蜜蜂螺原體Spiroplasma melliferum CH-1細胞骨架相關(guān)基因的研究.pdf

1、螺原體屬于柔膜菌綱，不似其他細菌有細胞壁，但是它僅靠單層膜即能維持螺旋狀的特殊形態(tài)和運動形式，它是研究運動性的模式生物，研究它的形態(tài)和運動對深入了解生物的基本規(guī)律有極其重要的意義。細胞的形態(tài)和運動方式與其細胞骨架有關(guān)，fib基因是螺原體中特有的基因，其編碼的Fib蛋白是螺原體細胞骨架的主要組成部分。mreB基因是編碼細胞骨架蛋白的相關(guān)基因之一，其編碼的MreB蛋白有維持螺原體獨特的螺旋細胞結(jié)構(gòu)的作用。因此研究螺原體細胞骨架相關(guān)基因mre

2、B、fib有助于進一步認識螺原體的形態(tài)變化和運動的機制。本研究在測定蜜蜂螺原體Spiroplasmamelliferum CH-1基因組序列的基礎上，應用生物信息學方法分析細胞骨架相關(guān)基因mreB和fib、研究mreB基因的外源表達情況，以及螺原體在非螺旋狀和螺旋狀時mreB、fib基因的表達差異，為今后深入研究MreB體外聚合作用，進一步研究其在體內(nèi)的聚合特點，以及mreB、fib基因的功能分析奠定基礎。主要研究結(jié)果有:
　　第

3、一、螺原體CH-1中含有5個mreB基因、1個fib基因，利用生物信息學的方法，對mreB1-mreB5和fib所編碼的蛋白質(zhì)進行分析，結(jié)果表明:(1) MreB1-MreB5的分子量分別為36、23、23、37、25 kD，其中MreB1的分子量與其他細菌（如Escherichia coli)中的分子量一致，均為36kD，預測Fib分子量為58 kD，與其他研究者所報道的大小相似;(2) MreB蛋白屬于MreB/Mbl蛋白質(zhì)家族，F(xiàn)

4、ib蛋白的N端（14-226的氨基酸位置）預測屬于磷酸化酶家族(Phosphorylase superfamily)，與Cohen-Krausz等的預測結(jié)果相似。(3)利用SWISS-MODEL自動同源建模，預測了螺原體CH-1 MreB蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)MreB1、MreB4、MreB5的蛋白結(jié)構(gòu)相似，有細微的差異，MreB2和MreB3的蛋白結(jié)構(gòu)相近，存在較小差異。Fib由于是螺原體中獨特的蛋白，并不能根據(jù)同源建模的方法得到整

5、個蛋白的三維結(jié)構(gòu)。(4)S.melliferum CH-1的MreB氨基酸與其他細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，MreB1-MreB5分別與其他螺原體相對應的MreB蛋白親緣關(guān)系較近。
　　第二、根據(jù)螺原體CH-1全基因組測序得到的細胞骨架相關(guān)基因mreB序列設計引物，首次克隆了螺原體的mreB1-mreB5基因，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)(表達質(zhì)粒為pET-28a)表達純化了MreB蛋白。在蛋白純化時發(fā)現(xiàn)E coil所表達的螺原體CH-1Mre

6、B1-MreB5目的蛋白存在于包涵體之中，需用含8 mol/L尿素的Binding Buffer才能溶解，屬于疏水性蛋白質(zhì)，結(jié)合生物信息學分析，推測表達的螺原體CH-1中的MreB蛋白可能都是疏水性蛋白，為今后研究MreB體外聚合作用以及進一步研究其在體內(nèi)的聚合特點奠定基礎。
　　第三、螺原體CH-1在培養(yǎng)過程中形態(tài)有明顯的變化，用暗視野顯微鏡觀察在延滯前期絕大部分螺原體成小點狀，對數(shù)生長期螺原體絕大多數(shù)呈螺旋狀，而在電鏡下觀察暗

7、視野顯微鏡下成小點狀的螺原體則呈各種不規(guī)則的近球形，或末端膨大的稍彎曲的桿狀。利用二步法的real-time PCR方法，以SYBR GreenⅠ染料法相對定量螺原體CH-1在螺旋狀和非螺旋狀時mreB1-mreB5、fib基因的表達，結(jié)果表明:(1)mreB1-mreB5和fib基因在非螺旋狀時的表達量相對于螺旋狀時表達量存在顯著差異。螺原體在典型的螺旋形時，mreB、fib基因的表達量比螺原體在非螺旋狀時表達量顯著提高，初步表明螺原

8、體CH-1維持螺旋形需要mreB和fib基因的參與，這些細胞骨架相關(guān)基因可能與螺原體的形態(tài)相關(guān);(2)螺原體從非螺旋狀生長到螺旋狀期間，fib基因表達的增幅水平大于mreB基因表達的增幅水平。推測對于螺原體CH-1螺旋形態(tài)的維持fib基因可能比mreB基因作用明顯，所以mreB、fib基因的功能有待進一步驗證。
　　本研究結(jié)果為今后進一步確定這些基因在蜜蜂螺原體CH-1形態(tài)和運動性方面的作用提供了重要信息，為進一步研究基因的功能奠