螺原體細(xì)胞骨架蛋白與其細(xì)胞形態(tài)關(guān)系的研究.pdf

1、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)是我國沿江地區(qū)重點(diǎn)開發(fā)的特種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物。近年來,隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和集約化養(yǎng)殖程度的不斷提高,各種病害問題日趨嚴(yán)重,給中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在中華絨螯蟹的眾多病害中,顫抖病是最常見、危害最為嚴(yán)重的一種。本課題組前期研究證明該病病原體為螺原體,并將其命名為中華絨螯蟹螺原體(Spiroplasma eriocheiris sp.nov)。雖然前期工作已經(jīng)完成了該病原體的

2、生物學(xué)特性與分類地位的研究,以及病原檢測和治療藥物的毒理實(shí)驗(yàn),但有關(guān)其細(xì)胞骨架蛋白功能方面的研究還沒有涉及,而螺原體的細(xì)胞骨架因?yàn)槠洫?dú)特性近年來成為國際研究的熱點(diǎn)。因此,本論文在中華絨螯蟹螺原體和非凡螺原體(Spiroplasma mirum)基因組測序和注釋工作的基礎(chǔ)上,運(yùn)用多種生物信息學(xué)軟件,對不同螺原體的細(xì)胞骨架蛋白(fib,EF-Tu和MreB1～5)進(jìn)行了一系列分析和比較,并開展了三種細(xì)胞骨架基因(Fib、EF-Tu和MreB

3、)的實(shí)時定量PCR檢測以及EF-Tu蛋白的原核表達(dá)和多抗制備。
　　 1.螺原體細(xì)胞骨架蛋白的生物信息學(xué)分析中華絨螯蟹螺原體(S.eriocheiris)是第一種發(fā)現(xiàn)于淡水甲殼動物中的螺原體,它在各生長時期的形態(tài)差異很大,而螺原體是無細(xì)胞壁的微生物,所以這種形態(tài)學(xué)上的變化很可能與細(xì)胞骨架有關(guān)。因此為了進(jìn)一步研究其與植物螺原體(柑橘螺原體,Spiroplasma citri)和昆蟲螺原體(非凡螺原體,Spiroplasma mir

4、um；蜜蜂螺原體Spiroplasma melliferum)以及其他細(xì)菌細(xì)胞骨架的關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)首先運(yùn)用多種生物信息學(xué)軟件對其細(xì)胞骨架蛋白基因(fib,EF-Tu和MreB1～5)進(jìn)行了一系列分析。結(jié)果表明:
　　 (1)這四種螺原體的堿基序列相似性較高,在79％-98％之間；而氨基酸相似性變化較大,在33％-99％之間。
　　 (2)用SWISS MODEL軟件預(yù)測四種螺原體和其他幾種細(xì)菌的骨架蛋白,并對它們做了比較,

5、發(fā)現(xiàn)不同螺原體的同類蛋白在三維結(jié)構(gòu)上幾乎完全相同,且與親緣關(guān)系相近的物種相似。例如,在各種細(xì)菌EF-Tu(延伸因子)蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖比較中,三種螺原體與立克次氏體(Richettsia)的結(jié)構(gòu)相似,但與其他細(xì)菌如支原體、大腸桿菌、衣原體等有所不同(圖2.1)。從三種螺原體Fib蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖比較中,可以看出其結(jié)構(gòu)相近,尤其是S.eriocheiris與S.mirum的三維結(jié)構(gòu)幾乎沒有區(qū)別,而與柑橘螺原體S.cirri有細(xì)微差異(圖2.

6、2)。
　　 2.細(xì)胞骨架蛋白的實(shí)時定量PCR檢測螺原體在培養(yǎng)基中生長不同時期時的形態(tài)差異很大。最新報道顯示蜜蜂螺原體(S.melliferum)BC3的細(xì)胞骨架包含三種主要成分:Fib、EF-Tu和MreB。因此結(jié)合已經(jīng)完成的S.eriocheiris和S.mirum的基因組信息,本實(shí)驗(yàn)選擇這3種細(xì)胞骨架蛋白基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測,分析它們在各個生長時期的表達(dá)量差異,探討其與細(xì)胞形態(tài)之間的關(guān)系,為今后研究中華絨螯蟹螺原體的

7、致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
　　 結(jié)果顯示,S.eriocheiris在對數(shù)期呈典型的螺旋狀,平臺期呈短棒狀,衰亡期則為球狀；與以上三個時期相對應(yīng)的RT-PCR結(jié)果顯示細(xì)胞骨架蛋白基因的表達(dá)量隨著對數(shù)期、平臺期、衰亡期逐漸下降?？梢钥闯龌虮磉_(dá)量與螺旋形態(tài)呈正相關(guān)。同樣地,S.mirum在對數(shù)期呈螺旋狀,但螺旋數(shù)較少,平臺期呈典型的螺旋形,螺旋數(shù)較多時還以分枝形式存在,衰亡期則為松散的絲帶狀；與以上三個時期相對應(yīng)的RT-PCR結(jié)果顯示細(xì)

8、胞骨架蛋白基因的表達(dá)量也是對數(shù)期較弱,平臺期較多,衰亡期最少。可以看出基因表達(dá)量也與螺旋形態(tài)呈正相關(guān)。綜上所述,推測Fib、EF-Tu和MreB這3種細(xì)胞骨架蛋白基因?qū)β菰w的螺旋形態(tài)起重要作用。
　　 3.中華絨螯蟹螺原體細(xì)胞骨架蛋白EF-Tu(延伸因子)的克隆、表達(dá)以及功能研究本實(shí)驗(yàn)首次從中華絨螯蟹螺原體基因組中獲得了一個編碼細(xì)胞骨架蛋白的基因EF-Tu。首先擴(kuò)增出EF-Tu的部分序列,與質(zhì)粒pET28連接后,成功轉(zhuǎn)入大腸桿

9、菌中擴(kuò)增。為了證明實(shí)驗(yàn)獲得的EF-Tu蛋白具有免疫原性,利用原核載體表達(dá)重組融合蛋白EF-Tu-His,采用Ni-NTA親和層析柱對該融合蛋白進(jìn)行了純化,用質(zhì)譜進(jìn)行鑒定,然后制備兔多克隆抗體。SDS-PAGE和蛋白免疫印跡表明該蛋白得到了成功表達(dá),且具有免疫原性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該蛋白是否為螺原體蛋白,本文對中華絨螯蟹螺原體各生長時期的總蛋白進(jìn)行了分離,并利用制備的EF-Tu多克隆抗體進(jìn)行檢測。Western Blotting檢測結(jié)果顯示

10、:多克隆抗體和總蛋白發(fā)生了特異性的免疫反應(yīng),在相應(yīng)的43KDa蛋白位置出現(xiàn)了免疫條帶,與預(yù)期的結(jié)果一致。
　　 為進(jìn)一步研究EF-Tu蛋白在各個時期的表達(dá)量差異,分別提取了S.eriocheiris對數(shù)期、平臺期、衰亡期的總蛋白,用制備的多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果表明,EF-Tu蛋白表達(dá)量隨著對數(shù)期、平臺期、衰亡期而逐漸增多,與螺原體的螺旋形態(tài)呈負(fù)相關(guān)。這可能有兩方面的原因:(1)EF-Tu是多功能蛋白,它可能只起著輔助連