非洲雛鴕鳥消化管的發(fā)育及Ghrelin在其中分布規(guī)律的研究.pdf

1、鴕鳥是世界上現(xiàn)存體形最大的草食性鳥類,具有很高的飼養(yǎng)價(jià)值。雛鴕鳥由于機(jī)體的各種器官系統(tǒng)尚未發(fā)育完善,抵抗力低,對(duì)機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的變化和病原的侵襲非常敏感,容易發(fā)病,從而影響其生長(zhǎng)。消化管是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的重要場(chǎng)所,它的發(fā)育程度決定了動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的情況,動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的多少影響動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育。非洲鴕鳥育雛期較長(zhǎng),在育雛期間,生長(zhǎng)發(fā)育緩慢,胃腸道疾病嚴(yán)重。為了提高非洲鴕鳥的育雛率,降低胃腸道疾病的發(fā)病率,科學(xué)家們已經(jīng)對(duì)非洲

2、鴕鳥展開(kāi)了大量的研究。但是到目前為止,有關(guān)非洲雛鴕鳥消化道發(fā)育規(guī)律的研究,尚未見(jiàn)過(guò)報(bào)道。
　　 Ghrelin是由日本科學(xué)家Kojima等人于1999年從小鼠的胃中提純并鑒定了的一種促生長(zhǎng)激素分泌受體的特定的內(nèi)源性配體的一種腦腸肽,由胃黏膜分泌,能影響動(dòng)物的攝食、飲水、消化道的活動(dòng)以及動(dòng)物體內(nèi)其它激素的分泌、從而影響動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育。現(xiàn)已證明哺乳動(dòng)物Ghrelin為28個(gè)氨基酸殘基的多肽,禽類的Ghrelin則由26個(gè)氨基酸殘基組

3、成的多肽。Ghrelin廣泛分布于多種動(dòng)物的胃、回腸、腎上腺、心房、乳房、口腔黏膜、食道、輸卵管、脂肪、膽囊、淋巴細(xì)胞、腎臟、脾臟、淋巴管、心臟、肺、肌肉、心肌、卵巢、精巢、胎盤、前列腺、胰腺、甲狀腺、皮膚、垂體、血管中,并且它的分布隨著動(dòng)物年齡的變化而變化,而到目前為止,未見(jiàn)非洲鴕鳥Ghrelin的研究報(bào)道。
　　 綜合以上兩個(gè)方面的因?yàn)?本課題利用石蠟切片HE染色技術(shù)、透射電鏡(TEM)技術(shù)、組織化學(xué)技術(shù)、免疫組化技術(shù)定位表

4、達(dá)(SABC)技術(shù)及反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)等綜合手段,從組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞、分子等多層次對(duì)雛鴕鳥消化管的形態(tài)結(jié)構(gòu)、發(fā)育特點(diǎn),Ghrelin的分布發(fā)育規(guī)律進(jìn)行全面、系統(tǒng)的研究,旨在為非洲鴕鳥胃腸道疾病的預(yù)防和治療提供可靠的理論依據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容和研究結(jié)果包括以下5個(gè)方面:
　　 1.非洲鴕鳥消化管的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)
　　 本試驗(yàn)以90d健康非洲雛鴕鳥為試驗(yàn)動(dòng)物,通過(guò)光鏡和電鏡樣本制作,采用大體解剖、石蠟切片、PAS染色

5、、嗜銀染色及HE染色技術(shù),研究雛鴕鳥消化管的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示:非洲鴕鳥的消化管由口咽腔、食管、腺胃、肌胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸構(gòu)成。非洲鴕鳥無(wú)嗉囊,其口咽腔,腺胃、肌胃、空腸和結(jié)腸比其它禽類的發(fā)達(dá),特別是結(jié)腸,位置占據(jù)了整個(gè)腹腔后半部的大部分；消化管的組織結(jié)構(gòu)從內(nèi)到外依次分為黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層；食管有粗大的皺襞,肌層發(fā)達(dá),有發(fā)達(dá)的食管腺；腺胃分有腺部和無(wú)腺部,在有腺部?jī)?nèi),腺體由位于固有膜的單管腺和位于黏

6、膜下層發(fā)達(dá)的復(fù)管狀腺組成,其中復(fù)管狀腺由大量的腺細(xì)胞、少量的內(nèi)分泌細(xì)胞和黏液細(xì)胞構(gòu)成；肌胃含有肌胃腺,并且黏膜肌層較明顯,由內(nèi)縱肌和外環(huán)肌組成；小腸絨毛較長(zhǎng),有分支現(xiàn)象,未見(jiàn)中央乳糜管；十二指腸的固有膜中有發(fā)達(dá)的腺體和集合淋巴小結(jié),黏膜下層內(nèi)無(wú)十二指腸腺；從十二指腸到回腸,腸絨毛的匯合及分支現(xiàn)象更加明顯,固有膜內(nèi)集合淋巴小結(jié)的數(shù)量逐漸減少,空腸的絨毛彎曲明顯；具有一對(duì)發(fā)達(dá)的盲腸；結(jié)腸特別發(fā)達(dá),有黏膜皺襞,黏膜上皮為復(fù)層柱狀上皮,其間夾有

7、杯狀細(xì)胞,腸絨毛短且發(fā)達(dá)。非洲鴕鳥消化管的這些形態(tài)學(xué)特點(diǎn),決定了非洲鴕鳥對(duì)粗纖維具有很強(qiáng)的消化吸收能力。
　　 2.雛鴕鳥消化管的發(fā)育特點(diǎn)
　　 本研究以1d、45d和90d健康非洲雛鴕鳥為試驗(yàn)動(dòng)物,利用大體解剖學(xué)、組織化學(xué)和形態(tài)計(jì)量學(xué)的方法,研究雛鴕鳥消化管的發(fā)育特點(diǎn)。研究結(jié)果顯示:鴕鳥的體重,消化管的重量和長(zhǎng)度隨日齡而增加；食管、腺胃和十二指腸的相對(duì)重量在90d達(dá)到高峰,肌胃、空腸、回腸以及所有大腸的相對(duì)重量在45d

8、達(dá)到高峰；腺胃單管腺和復(fù)管腺的厚度、肌胃腺的高度、肌胃黏膜肌層的厚度、腸絨毛的高度和寬度,肌層的厚度與日齡呈正相關(guān)；腸絨毛的高度與隱窩深度的比值在不同腸段,其變化趨勢(shì)也各有差異:在空腸,從1d-90 d比值逐步減少；而在十二指腸和回腸,從1d-45d比值逐步減少,而從45d-90 d比值逐步增加；小腸絨毛杯狀細(xì)胞和隱窩杯狀細(xì)胞的數(shù)量從1d-45d隨日齡增加而增加,45d-90d隨日齡增加而減少。絨毛杯狀細(xì)胞的數(shù)量在1d,空腸最高；45d

9、,回腸最高。隱窩杯狀細(xì)胞的數(shù)量在1d和90d時(shí),回腸最高；45d時(shí),十二指腸最高。這些結(jié)果揭示非洲鴕鳥消化道的發(fā)育從1d-90d逐步完善；特別是1d-45d,從消化道的重量、長(zhǎng)度、腸絨毛的特點(diǎn)以及腸杯狀細(xì)胞的變化可以看出其發(fā)育極不完善。因此,在非洲鴕鳥的飼養(yǎng)管理中,應(yīng)加強(qiáng)1d-45d的飼養(yǎng)管理,在這階段應(yīng)飼喂易消化且營(yíng)養(yǎng)全面的日糧,這樣有助于減少雛鴕鳥消化系統(tǒng)疾病。
　　 3.Ghrelin陽(yáng)性細(xì)胞在雛鴕鳥胃腸道的分布及發(fā)育規(guī)律

10、
　　 本研究以1d、45d和90d健康非洲雛鴕鳥為試驗(yàn)動(dòng)物,利用免疫組織化學(xué)SABC技術(shù)對(duì)非洲鴕鳥消化管內(nèi)Ghrelin陽(yáng)性細(xì)胞(Ghrelin-ic)的分布、形態(tài)學(xué)特點(diǎn)以及發(fā)育變化進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示:Ghrelin-ic分布于整個(gè)胃腸道；腺胃,大量的Ghrelin-ic位于黏膜下層的復(fù)管腺內(nèi),少量的陽(yáng)性細(xì)胞位于黏膜層的單管腺內(nèi)；肌胃,Ghrelin-ic位于黏膜層的黏膜上皮下陷的漏斗狀的隱窩上皮細(xì)胞內(nèi)；腸道,Ghrelin

11、-ic數(shù)量較胃內(nèi)少,分布于整個(gè)腸道的黏膜層的隱窩和腸絨毛上皮細(xì)胞之間,黏膜下層和肌層未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞。Ghrelin-ic根據(jù)其游離面是否到達(dá)腔面可分為兩類,即“開(kāi)放型”細(xì)胞和“閉合型”細(xì)胞,在腺胃和肌胃,主要是“閉合型”陽(yáng)性細(xì)胞,“開(kāi)放型”陽(yáng)性細(xì)胞較少,而在小腸和大腸,主要是“開(kāi)放型”陽(yáng)性細(xì)胞,“閉合型”陽(yáng)性細(xì)胞較少；Ghrelin-ic分布密度總的來(lái)說(shuō),在腺胃最高,從十二指腸、空腸、回腸、肌胃、盲腸、結(jié)腸到直腸分布密度逐步降低；在腺胃,

12、陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量從1-45d逐步增加,并且在45d出現(xiàn)一個(gè)峰值；在肌胃和小腸,陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量從1-90d逐步增加,并且在90d出現(xiàn)一個(gè)峰值；從90-334d,Ghrelin-ic的數(shù)量在胃和小腸都是逐步增加,但差異不顯著。以上結(jié)果說(shuō)明:Ghrelin-ic在非洲鴕鳥整個(gè)胃腸道內(nèi)有分布,并且其數(shù)量隨著機(jī)體的發(fā)育而變化,總的趨勢(shì)是:從1-90d,隨著日齡的增加而逐步增加。根據(jù)這些變化可以推論,Ghrelin對(duì)非洲鴕鳥消化管的發(fā)育起一定的作用。

13、
　　 4.非洲鴕鳥Ghrelin基因的克隆和序列分析
　　 根據(jù)GenBank中所公布雞(GeneBank登錄號(hào):AB075215)的Ghrelin核苷酸序列,設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物,以45d非洲鴕鳥腺胃組織中總RNA為模板,采用RT-PCR法,擴(kuò)增出Ghrelin成熟蛋白編碼cDNA序列,將此擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體,進(jìn)行PCR鑒定及序列測(cè)定與分析。結(jié)果表明:從非洲鴕鳥腺胃中擴(kuò)增出了Ghrelin基因,擴(kuò)增產(chǎn)

14、物為191bp；利用DNAMAN將其轉(zhuǎn)化成氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)非洲鴕鳥Ghrelin的成熟蛋白,由28個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成；同一性分析表明,非洲鴕鳥Ghrelin基因與雞、鴨、鵝、火雞、鴯鹋、日本鵪鶉Ghrelin基因相應(yīng)序列的同一性分別為95％、94％、84％、83％、84％、84％和82％；氨基酸同一性與鴯鹋、雞、鴨、鵝、火雞和鵪鶉分別為88.9％、73％、69.8％、74.6％、73％和68.3％；基因和蛋白氨基酸同一性分析結(jié)果說(shuō)明Ghr

15、elin是一組在進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)；利用DNAMAN對(duì)Ghrelin進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)非洲鴕鳥與鴯鹋的親緣關(guān)系最近。非洲鴕鳥Ghrelin成熟蛋白cDNA的成功克隆,為進(jìn)一步研究非洲鴕鳥Ghrelin全基因結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)與調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。
　　 5.Ghrelin基因在非洲雛鴕鳥胃腸道的表達(dá)及發(fā)育性變化
　　 根據(jù)GenBank中所公布雞(GeneBank登錄號(hào):AB075215)的Ghrelin核苷酸序列,

16、設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物,以1d、45d和90d健康非洲雛鴕鳥胃腸道組織中的總RNA為模板,采用RT-PCR法,對(duì)Ghrelin mRNA在非洲雛鴕鳥胃腸道的表達(dá)及發(fā)育性變化進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:Ghrelin mRNA除在空腸、結(jié)腸不表達(dá)外,在腺胃、肌胃、十二指腸、回腸、盲腸和直腸均有表達(dá)；Ghrelin mRNA在胃和小腸組織中的表達(dá)隨著日齡的變化而變化:1d時(shí),只在腺胃中表達(dá)；45d時(shí),Ghrelin mRNA在腺胃、肌胃及回腸中都