羅漢果二倍體及四倍體遺傳變異研究.pdf

1、羅漢果Siraitia grosvenorii(Swingle)C.Jeffrey隸屬于葫蘆科(Cucurbitaceae)羅漢果屬(Siraitia),為多年生草質(zhì)藤本植物,是我國特有的藥用和甜料植物,具止咳祛痰、涼血舒胃、潤腸通便等作用。其主要活性成分為羅漢果甜苷V,具強烈甜味,為蔗糖的300～500倍,具抗氧化、免疫調(diào)節(jié)及抗癌的作用。羅漢果提取物低熱、無毒,是一種純天然的甜味劑及理想的保健品,可為糖尿病和肥胖病患者使用。羅漢果種子

2、數(shù)量多、重量大,占果實鮮重的44％,干重的70％,但幾乎不含羅漢果皂苷。因此羅漢果無籽化是羅漢果生產(chǎn)中亟待解決的關(guān)鍵問題,而且無籽羅漢果也成為羅漢果育種研究的熱點。
　　 2005年本課題組在羅漢果伯林3號和ND的后代中發(fā)現(xiàn)一突變株,植株高大,莖粗葉厚,花大敗育,后代無籽。本研究首次對羅漢果正常株及其突變株從細胞學(xué)、基因組及基因表達水平進行初步探討,研究羅漢果正常株與突變株的遺傳變異情況及無籽羅漢果基因表達情況。主要研究結(jié)果如下

3、:
　　 1、染色體核型的研究結(jié)果顯示羅漢果正常株為二倍體,染色體數(shù)目為2n=2x=28,而突變株為四倍體,染色體數(shù)目為2n=4x=56,其后代無籽羅漢果為三倍體,染色體數(shù)目為2n=3x=42條,同時驗證了突變株為四倍體。這是首次對羅漢果多倍體方面進行的報道研究。
　　 2、本實驗采用SRAP分子標(biāo)記方法對羅漢果二倍體及四倍體的基因組水平進行遺傳變異分析。用196對引物組合對兩者的基因組進行擴增,其中9對引物組合未能擴增

4、出條帶。篩選得到的189對引物組合共擴增出約4573條帶,其中577條(12.6％)為差異條帶,1998條(87.4％)為共有條帶。大部分引物組合均能擴增出條帶,獲得的條帶長度大多集中在100～800bp之間,平均每對引物組合擴增條帶數(shù)為12.1。結(jié)果表明通過SRAP分子標(biāo)記方法得出羅漢果二倍體及四倍體株系之間基因組DNA的SRAP多態(tài)性較低,遺傳差異較小。
　　 3、采用SRAP-cDNA方法對羅漢果二倍體及四倍體的基因表達水

5、平進行差異分析。用196對SRAP引物組合對兩者的基因表達水平cDNA進行多態(tài)性擴增,其中63對引物組合未能擴增出條帶。篩選得到的133對引物組合共擴增出約2917條帶,其中289條(9.9％)為差異條帶,1313條(90.1％)為共有條帶。對其中穩(wěn)定出現(xiàn)的明顯差異片段進行回收、克隆及測序,共獲得92條差異表達的基因片段,其中77.2％與已知基因具高度同源性,9.8％為編碼未知蛋白基因,13.0％為可能的編碼新蛋白基因。對已知序列的結(jié)果

6、分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)序列都與光合、呼吸及抗性相關(guān)基因具有很高的同源性,其中比較重要的蛋白質(zhì)如:核銅糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、丙酮酸激酶、過氧化物酶膜轉(zhuǎn)運蛋白、NBS-LRR抗性蛋白、蛋白磷酸酶等。序列的功能分析結(jié)果表明已知基因編碼蛋白涉及到生物學(xué)的諸多方面,其編碼的蛋白主要屬于:離子通道、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝途徑、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白合成、生長發(fā)育、能量代謝等。這些蛋白質(zhì)在植物生長發(fā)育中都起著重要的調(diào)節(jié)作用,如:鋅指蛋白、

7、分子伴侶、促有絲分裂素活化激酶、轉(zhuǎn)錄因子IWS1、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、內(nèi)膜蛋白、胞外孔道蛋白、纖維素合酶、細胞色素P450、糖基轉(zhuǎn)移酶GT8、氧化還原酶等。以上實驗結(jié)果從一定程度上表明羅漢果四倍體在抗逆性及光合能力方面更優(yōu)于二倍體植株。這也為多倍體在表型及生物學(xué)方面優(yōu)于二倍體的現(xiàn)象提供了分子證據(jù)。
　　 4、利用Solexa高通量測序技術(shù)對羅漢果二倍體后代的正常種子及四倍體后代無籽羅漢果干癟種子進行轉(zhuǎn)錄組和表達譜測序。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果共

8、得到64372條Unigene,與代謝途徑相關(guān)的Unigene共17593條。表達譜測序得到87350條referencetags及41678條genes。通過分析發(fā)現(xiàn)占mRNA總量76％～77％的是種類不到5.50％～5.8％的少數(shù)mRNA,而占種類58％～62％的mRNA全部加起來不到mRNA總量的4.2%～4.5％。對差異基因進行比較發(fā)現(xiàn)有1748個基因上調(diào),2037個基因下調(diào)。
　　 本文首次對羅漢果多倍體及其后代無籽羅

9、漢果進行報道研究,并從細胞學(xué)、基因組及基因表達水平進行初步探討,研究羅漢果正常株與突變株的遺傳變異情況及無籽羅漢果基因表達情況。這為多倍體羅漢果及無籽羅漢果形成的遺傳機理、種子形成及發(fā)育相關(guān)基因等方面的研究提供重要的基因資源,也為克隆基因、研究其表達和調(diào)控機制及功能提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù),同時為應(yīng)用生物技術(shù)方法實現(xiàn)羅漢果無籽化,提高生產(chǎn)中羅漢果有效成分提取率提供了技術(shù)支持,為培育無籽羅漢果及新資源新品種的開發(fā)利用提供理論依據(jù),提高育種的預(yù)見性和