不結球白菜小分子量熱激蛋白基因克隆及表達分析.pdf

1、遇到高溫脅迫時植物體內(nèi)會產(chǎn)生應激蛋白--熱激蛋白，其中植物小分子量熱激蛋白含量最為豐富、種類繁多。小分子量熱激蛋白的分子量在17～30kDa之間。高等植物中含有至少6種小分子量熱激蛋白，分別定位于細胞質(zhì)、葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在常溫下植物體內(nèi)小分子量熱激蛋白基因不表達，高溫時小分子量熱激蛋白則快速積累。
　　 近年來，關于高溫誘導熱激蛋白以及熱激蛋白提高植物耐熱性的研究取得了重要進展。然而，關于高溫誘導熱激蛋白基因及其在低溫防

2、御中作用的研究相對較少。本研究從不結球白菜中分離到小分子量熱激蛋白基因BcHSP，表達模式和功能分析表明，這個基因的表達受高溫逆境誘導，高溫、低溫條件下過量表達對大腸桿菌均有保護作用，構建了過量表達載體進行了轉(zhuǎn)基因初步鑒定，為進一步BcHSP基因研究打下基礎。
　　 1.利用同源序列設計兼并引物，通過RT-PCR和RACE方法從不結球白菜葉片中克隆到小分子量熱激蛋白基因的中間片段，通過5’-RACE和3’-RACE分別克隆到5’

3、片段和3’片段，拼接后設計特異引物擴增到全長722bpcDNA，命名為BcHSP（DDBJ登錄號：AB367955），ORF為473bp，編碼157個氨基酸的多肽，理論等電點(pI)為5.31，分子量約為15.98kDa。核苷酸序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，BcHSP與芥藍相似性最高達98％.氨基酸序列進行比對發(fā)現(xiàn)，相似性均在65％以上，說明HSP具有高度保守性。HSP的高度保守性說明他們在生物生命活動中具有重要的作用。聚類分析結果顯示，BcHS

4、P基因與芥藍(CAB93512)最先聚為一類，親緣關系最近，蕪菁(AAB72190)單個聚一類、然后與擬南芥（NP-175759）、豌豆(P19243)、大豆(P02519)等聚為一類，最后與水稻(EAY89381)聚類，親緣關系相對較遠。實時定量檢測表明，不結球白菜BcHSP轉(zhuǎn)錄表達受熱激誘導，以葉片中表達量最高，BcHSP在不結球白菜葉片中表達特征說明它可能與植物葉片的耐熱性關系更為密切。
　　 2.不結球白菜幼苗經(jīng)42℃熱

5、激后，其幼苗的耐冷性明顯增強，膜傷害程度降低。熱激處理組的冷害指數(shù)仍低于對照組，差異顯著(P＜0.05)，并且經(jīng)熱激的幼苗鮮重比對照增加了51％，苗高增加了40％。熱激使不結球白菜幼苗在冷脅迫和恢復生長過程中電解質(zhì)的滲透和丙二醛(MDA)含量均比對照大為下降，差異顯著(P＜0.05)，顯示熱激降低了不結球白菜幼苗的脂質(zhì)過氧化水平，并且使幼苗的抗氧化系統(tǒng)中的關鍵酶超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)的活性在

6、冷脅迫及恢復生長2d時仍保持比對照組高，差異顯著(P＜0.05)。熱激處理后與對照組的幼苗SOD同工酶的電泳圖譜顯示，熱激誘導使幼苗在低溫脅迫前后SOD同工酶譜帶均比對照組強，以上與冷害相關的生理生化指標測定結果顯示，熱激處理增強了不結球白菜幼苗的耐冷能力。熒光實時定量分析表明BcHSP的表達量與耐冷性相一致。低溫(4℃)脅迫下，在大腸桿菌中異源表達BcHSP可維持大腸桿菌較高的細胞活力，這些結果表明BcHSP合成與不結球白菜幼苗耐冷性