番茄線粒體小分子熱激蛋白基因啟動子的分子克隆.pdf

1、該研究工作主要包括以下三個部分:第一部分:用番茄MT sHSP cDNA(LeHSP23.8)內部特異引物gMT/F、gMT/R,對番茄(Lycopersicon esc μ llentum)中疏四號基因組DNA進行PCR擴增,產(chǎn)物連入T載體測序,發(fā)現(xiàn)基因內部有245bp內含子.第二部分:用位于番茄MT sHSP cDNA下游的單一酶切位點EcoR Ⅰ,與能克隆入pBS Ⅱ(KS+)的8種酶(BamHⅠ、Bgl Ⅱ、Kpn Ⅰ、Pst

2、Ⅰ、Sac Ⅰ、Spe Ⅰ、Xba Ⅰ、Xho Ⅰ)分別雙酶切番茄"中蔬4號"基因組DNA,以含有內含子的Mt sHSP基因片段為探針做Southern雜交;根據(jù)Southern雜交結果,預測MT sHSP基因上游調控區(qū)物理圖譜.結果顯示,Kpn Ⅰ與EcoR Ⅰ雙酶切的基因組DNA的雜交片段約3Kb,包括2Kb左右的上游調控序列,適合于建質粒文庫.因此,回收Kpn Ⅰ與EcoR Ⅰ雙酶切的基因組DNA 3Kb左右的片段,連入同樣酶切的

3、pBSⅡ KS+載體中,轉化大腸桿菌感受態(tài),復蘇后搖菌,提取質粒,因而建成含有MT sHSP基因上游調控區(qū)2Kb左右的質粒文庫.用巢式PCR方法對質粒文庫進行擴增,得到的片段進行序列測定,從而克隆出MT sHSP基因起始密碼子上游1915bp的上游調控序列,包括了MT sHSP基因起始密碼子上游的5'UTR區(qū).在PlantCARE數(shù)據(jù)庫中搜索我們分離到的MT sHSP基因啟動子后,發(fā)現(xiàn)在啟動子序列中除了TATA-box、CAAT外,還有

4、典型的熱激蛋白調控所必需的熱休克元件HSE以及其它一些與脅迫反應有關的元件ABRE、C-repeat_DRE、TCA-element、AP-1等.第三部分:為了檢測MT sHSP基因上游調控區(qū)的活性,將克隆的1.9Kb全長調控區(qū)構建入植物表達載體pBl121中,得到由MT sHSP基因啟動子驅動GUS基因表達的TMP-pBI重組表達載體.然后將TMP-pBI重組質粒用凍融法轉化農桿菌,利用葉圓盤法對番茄進行Ti質粒介導的遺傳轉化,同時以