食品科學(xué)與工程畢業(yè)論文魚蛋白生物發(fā)酵液的抗氧化性和功能性研究

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　　（20 屆）</b></p><p>　　魚蛋白生物發(fā)酵液的抗氧化性和功能性研究</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 食品科

2、學(xué)與工程 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b>&l

3、t;/p><p>　　摘要·································

4、;····································

5、83;·····················1</p><p>　　ABSTRACT ·········

6、3;····································&#

7、183;································· 2</p><

8、p>　　1 前言···································

9、;····································

10、83;················3</p><p>　　1.1魚蛋白發(fā)酵液的研究現(xiàn)狀··············

11、;····································

12、83;······5</p><p>　　1.2魚蛋白發(fā)酵液的應(yīng)用前景························

13、;································5</p><p>　　2 實(shí)

14、驗(yàn)材料、主要儀器與試劑···································

15、;························6</p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料·······&

16、#183;····································

17、;·································6</p><p>

18、;　　2.2 主要儀器···································

19、;····································

20、83;····6</p><p>　　2.3 主要試劑···························

21、;····································

22、83;·············7</p><p>　　3 實(shí)驗(yàn)方法··················&

23、#183;····································

24、;···························6</p><p>　　3.1 魚蛋白發(fā)酵液的提取···&#

25、183;····································

26、·····················6</p><p>　　3.2 魚蛋白發(fā)酵液抗氧化能力·········&

27、#183;····································

28、;··········6</p><p>　　3.3 魚蛋白發(fā)酵液功能性····················&#

29、183;····································

30、·····6</p><p>　　4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論··························&

31、#183;····································

32、;·········9</p><p>　　4.1魚蛋白發(fā)酵液的抗氧化性·····················&

33、#183;···································9<

34、/p><p>　　4.2魚蛋白發(fā)酵液的功能性·······························&#

35、183;···························12</p><p>　　5 小結(jié)····&

36、#183;····································

37、;····································

38、83;·········14</p><p>　　參考文獻(xiàn)······················&#

39、183;····································

40、·························14</p><p>　　[摘要] 本文以小雜魚蛋白生物發(fā)酵液為原料，系統(tǒng)研究該魚蛋白發(fā)酵液體外抗氧化性能，包括清除

41、DPPH自由基的能力、還原力、金屬螯合力和羥自由基清除力，同時(shí)測(cè)定發(fā)泡性、溶解性和乳化性在內(nèi)的魚蛋白生物發(fā)酵液的功能性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)魚蛋白生物發(fā)酵液的蛋白濃度為40.8 μg/mL時(shí)，清除DPPH自由基清除率和羥自由基清除率分別達(dá)到46.33%和14.00%，還原力吸光值為0.190；蛋白濃度為13.6 μg/mL的魚蛋白生物發(fā)酵液的金屬螯合力達(dá)到12.50%。該魚蛋白生物發(fā)酵液具有一定的食品功能性，當(dāng)魚蛋白生物發(fā)酵液的pH為10時(shí)

42、，發(fā)泡性最好達(dá)到138.10%；當(dāng)魚蛋白生物發(fā)酵液的pH在區(qū)間2-4內(nèi)，溶解度達(dá)到89.00%，在區(qū)間5-9內(nèi)，溶解度達(dá)到90.10%，在區(qū)間10-12內(nèi)，溶解度達(dá)到96.50%；當(dāng)魚蛋白生物發(fā)酵液pH為8時(shí)乳化性最好，乳化形成指數(shù)達(dá)到3.180m²/mL，乳化穩(wěn)定指數(shù)趨于無(wú)窮。</p><p>　　[關(guān)鍵詞] 低值小雜魚；蛋白發(fā)酵液；抗氧化性；食品功能性 </p><p>　　

43、[Abstract] This protein solution in low-value little fish as raw material, and it's antioxidation effect in fish protein fermentation was determined, including: the ability to clear the DPPH free radical, reducing po

44、wer, metal chelation and hydroxyl radical scavenging ability, and its functions is also determined, including foaming capacity, emulsion activity index and solubility.The results show that:when protein concentration was

45、40.8μg/mL, the optimum conditions of DPPH free radical scavengin</p><p>　　[Key words] Low-value little fish;Fish protein fermentation;Antioxidant activity; Food functionality</p><p><b>　　1

46、 前言</b></p><p>　　1.1 魚蛋白發(fā)酵液的研究現(xiàn)狀</p><p>　　自由基是含有未成對(duì)電子的原子、分子或原子團(tuán),性質(zhì)活潑,易奪取其它分子或原子上的電子,從而破壞其它分子或原子的結(jié)構(gòu)。在生物體生命活動(dòng)的氧化代謝過(guò)程中，不斷地產(chǎn)生各種自由基，自由基會(huì)引發(fā)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化,加快機(jī)體的衰老過(guò)程,并可誘發(fā)心血管、癌癥等疾病[1，2]。超氧陰離子自由基(O2·)

47、是全部氧自由基中首先生成的，本身有毒害作用，還可通過(guò)歧化反應(yīng)產(chǎn)生H2O2，然后生成羥基自由基(·OH) [3]。羥自由基(-OH)是生物體內(nèi)最活潑的活性氧，可以引發(fā)許多病理變化，例如引發(fā)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，并損傷膜結(jié)構(gòu)及其功能等[4]。</p><p>　　蛋白質(zhì)的功能性能變化多是氧化引起的，比如乳化性和持水性等方面變化[5]。自由基過(guò)剩是氧化的根本原因，因此，自由基清除率能直接反應(yīng)抗氧化性

48、?？寡趸缘捏w外測(cè)定有多種，常用有還原力、DPPH自由基清除率、金屬螯合率及脂質(zhì)的過(guò)氧化抑制能力測(cè)定等[6]。自由基不僅在食品行業(yè)中引起關(guān)注，在消費(fèi)人群中也是。數(shù)據(jù)顯示，食物脂肪中自由基介質(zhì)的氧化是在食品加工和儲(chǔ)藏過(guò)程中引起含脂食物質(zhì)量惡化的主要原因之一，還有食用油也是[7]。</p><p>　　在正常的生理代謝過(guò)程中，人體會(huì)產(chǎn)生少量的含氧自由基,如O2-·、·OH和H2O2等,體內(nèi)的自由基

49、總處于不斷產(chǎn)生與消除的動(dòng)態(tài)平衡中。少量的氧自由基不僅對(duì)人體不會(huì)造成危害，甚至可以幫助人體傳遞維持生命活動(dòng)能量的供應(yīng),增強(qiáng)身體免疫力,抑制腫瘤產(chǎn)生等[8]。如果人體內(nèi)的自由基產(chǎn)生數(shù)量過(guò)多,會(huì)造成脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子受到攻擊,接著細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞,從而干擾人體的正常代謝活動(dòng),引發(fā)疾病,更有加速人體衰老 [9]。</p><p>　　許多研究顯示，由于酶解，在完全蛋白質(zhì)中常見的功能性如溶解性、凝膠性、乳化性

50、和粘性等與之前不同，酶解產(chǎn)物很大程度由分子大小或者水解度決定。蛋白質(zhì)的溶解度除與自身結(jié)構(gòu)有關(guān)外，還受pH、溫度、蛋白濃度和離子強(qiáng)度的影響。蛋白質(zhì)的一些功能性如發(fā)泡性、乳化性、凝膠性和增稠作用與它的溶解度有關(guān)。</p><p>　　1.2魚蛋白發(fā)酵液的應(yīng)用前景</p><p>　　黃代青等采用化學(xué)發(fā)光法，通過(guò)桑葉提取液對(duì)體外氧自由基清除效果和對(duì)果蠅壽命的影響進(jìn)行初步研究。他們認(rèn)為，桑葉是通過(guò)

51、有效的自由基清除作用（特別是羥自由基）從而達(dá)到防治疾病的作用[10]。</p><p>　　隨著人們生活水平的提高，他們對(duì)于抗氧化劑的要求也越來(lái)越高，期望以天然抗氧化劑來(lái)減少合成抗氧化劑的應(yīng)用，從而減少抗氧化劑造成的毒副作用，因此他們對(duì)于天然抗氧化劑的研發(fā)抱有很大期望。魷魚蛋白通過(guò)酶解得到的水解產(chǎn)物具有較好的抗氧化性，但同時(shí)其乳化性和起泡性也發(fā)生改變。肖楓等人[11] 利用前魷魚漿通過(guò)菠蘿蛋白酶水解，對(duì)羥自由基的

52、清除率達(dá)到0.6%。另外資料顯示，海棒糙膠原蛋白水解物對(duì)超氧陰離子的清除率可達(dá)52.2%。水解產(chǎn)物的羥自由基清除率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，酶解8h得到的魷魚水解物的羥自由基清除率達(dá)到71.5%。因此研究證明魷魚水解物對(duì)Fenton體系產(chǎn)生的羥自由基具有較強(qiáng)的清除力。</p><p>　　胡敏等人[12]采用比色法來(lái)測(cè)定銀杏葉提取物的羥自由基清除率，實(shí)驗(yàn)得出銀杏提取物具有較好的羥自由基清除率；Joyeux等人 [

53、13]的研究結(jié)果表明,GBE清除自由基和抗氧化作用與銀杏萜內(nèi)酯無(wú)關(guān),而與銀杏黃酮有關(guān)，銀杏葉粗提物比精提物的水溶性好，從而提高了粗提物的抗氧化性，另外發(fā)現(xiàn)生物膜上的親脂類強(qiáng)的黃酮類化合物的抗氧化性也強(qiáng)，但略弱于Vc。王靜等[14]利用海參自身的蛋白酶使其機(jī)體能夠自溶，通過(guò)研究酶解液中不同分子量的海參多肽的抗氧化性，均優(yōu)于天然抗氧化劑抗壞血酸，其不同組肽對(duì)三種氧自由基的清除能力順序?yàn)椋篛2-·> H2O2>·

54、;OH。</p><p>　　香蘭素又名香草醛,是天然的植物香料,主要存在香子蘭科植物的果實(shí)中,它在化學(xué)工業(yè)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、輕工業(yè)上都有廣泛應(yīng)用,是醫(yī)藥化工中重要的原料或中間體,是用來(lái)制造治療心臟病、高血壓、皮膚病的常用藥物。而香料在食品上的應(yīng)用,主要是增添食物色澤，改善食品風(fēng)味。此外,研究發(fā)現(xiàn)一些有防止食品變質(zhì)的抗氧化及抗菌作用的香料，如:姜黃、迷迭香、百里香、丁香等都具有較強(qiáng)的抗氧化性[15]。</p>

55、<p>　　Hordur等[16]從鮭魚幽門垂中提取內(nèi)源酶提取物,鮭魚肉通過(guò)酶水解得到的水解蛋白具有良好的乳化性。蛋白質(zhì)的溶解性決定了蛋白、油、水體系的乳化性和乳化穩(wěn)定性[17]。這是由于在油-水界面上蛋白質(zhì)膜的穩(wěn)定性，同時(shí)由起促進(jìn)作用的蛋白質(zhì)-油相和蛋白質(zhì)-水相的相互作用決定的。Wu H C等[18] 利用鯖魚蛋白分別通過(guò)自溶法和商業(yè)用酶法酶解,獲得3種活性多肽,具有很好的DPPH清除作用和亞油酸自動(dòng)氧化抑制作用。Jun

56、 S Y等[19]從金槍魚的水解產(chǎn)物中分離得到多種抗氧化活性肽，研究表明多肽的功能特性與分子量大小密切相關(guān),不同分子量的抗氧化肽,表現(xiàn)出了不同的抗氧化性。蛋白質(zhì)是一種表面活性劑，不僅能降低水和油的表面張力，易于乳化，同時(shí)能分散在非連續(xù)向何連續(xù)相之間的界面上，阻止非連續(xù)相的聚集，起到穩(wěn)定乳狀液的作用[20]。 </p><p><b>　　2本課題研究的意義</b></p>&l

57、t;p>　　本課題研究的是以小雜魚蛋白生物發(fā)酵液為原料，對(duì)其抗氧化性應(yīng)用進(jìn)行研究，包括DPPH自由基清除率、金屬螯合率等進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)測(cè)定，對(duì)于天然抗氧化劑的開發(fā)利用具有重要意義，同時(shí)測(cè)定其功能性，為其今后的功能性產(chǎn)品開發(fā)提供了研究基礎(chǔ)。</p><p>　　3 實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器與試劑</p><p><b>　　3.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p>&

58、lt;p><b>　　實(shí)驗(yàn)室自制。</b></p><p><b>　　3.2 主要儀器</b></p><p><b>　　3.3 主要試劑</b></p><p><b>　　4 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　4.1 魚蛋白發(fā)酵液的提取&

59、lt;/p><p>　　4.1.2 魚蛋白發(fā)酵液的提取工藝流程</p><p>　　小雜魚（原料）→清洗→切塊→均質(zhì)→滅菌→接種→發(fā)酵→濾渣</p><p><b>　　↓</b></p><p>　　濾液→冰凍保藏→成品 ↓</p><p>

60、<b>　　冷凍干燥→成品</b></p><p><b>　　操作要點(diǎn)：</b></p><p>　　1. 選取新鮮的低值小雜魚，去頭去尾，切塊，洗凈，在不加水的前提下放適量魚塊高速分散均質(zhì)機(jī)中粉碎。按照裝液量為96.02mL，V水：V魚=1.6：1，加入3.98%葡萄糖（按照裝液量計(jì)算），將處理好的魚漿裝入錐形瓶，調(diào)pH=7.0，然后放入高壓

61、滅菌鍋，于120℃條件下滅菌20-30min。滅菌好可放置于室溫中。</p><p>　　2. 配制液體培養(yǎng)基，調(diào)pH=7.0，于高壓滅菌鍋中滅菌，條件如上。發(fā)酵魚漿前，可在凈化臺(tái)中，按照2%接種量（約5mL）移取液體培養(yǎng)液于試管中，然后將活化的菌種接種2環(huán)到液體培養(yǎng)液中，包扎好放置恒溫箱中培養(yǎng)24h。</p><p>　　3. 隔天將恒溫箱中的液體培養(yǎng)液取出，于凈化臺(tái)上將液體培養(yǎng)液接種到

62、裝有已滅菌的魚漿的錐形瓶中，然后設(shè)置搖床，37℃，150r∕min，搖24-36h。</p><p>　　4. 將已發(fā)酵好的魚漿用循環(huán)水多用真空泵抽提魚蛋白液，裝瓶，放入冰箱備用。</p><p>　　備注：移取液體培養(yǎng)液于試管中或者將已接種的液體培養(yǎng)液移至魚漿時(shí)，所用的移液管頂部須塞一小團(tuán)棉花，傾斜移取溶液。</p><p>　　4.2 魚蛋白發(fā)酵液抗氧化能力&l

63、t;/p><p>　　4.2.1 清除DPPH自由基的能力測(cè)定</p><p>　　1mL樣品同1mL 99.5% 乙醇混合，加上250 μL濃度為0.02% DPPH 99.5% 乙醇液劇烈混合，混合物在暗室溫度下放置60min，然后測(cè)定在517nm處的吸光值。根據(jù)以下公式測(cè)定DPPH自由基清除率：</p><p>　　DPPH自由基清除率（%）=

64、 </p><p>　　備注：99.5%乙醇調(diào)零。</p><p>　　4.2.2 還原力測(cè)定</p><p>　　取1mL不同蛋白濃度樣品溶液，加入1mL 0.2mol/L pH6.6的PBS溶液，再加入1mL 1%的鐵氰化鉀，在50℃水浴中20min后,急速冷卻，加入1mL 10%的三氯乙酸，然后在3000r/min的離心機(jī)離心5mi

65、n，取上清液2mL，加入2mL蒸餾水再加入0.8mL 0.1%氯化鐵，混合均勻10min，然后700nm處測(cè)定吸光值，吸光值高表示還原力強(qiáng)，自由基清除率也越高。根據(jù)以下公式測(cè)定還原力：</p><p><b>　　還原力=樣品-空白</b></p><p><b>　　備注：蒸餾水調(diào)零。</b></p><p>　　4.2

66、.3 金屬螯合力測(cè)定</p><p>　　1.5mL樣品液同1.5mL蒸餾水混合，然后同0.1mL 2mM FeCl2 和0.2mL 5mM菲咯嗪混合，室溫放置20min，測(cè)定在562nm處的吸光值。根據(jù)以下公式測(cè)定金屬螯合率：</p><p>　　備注：菲咯嗪現(xiàn)配先用，呈白色。</p><p>　　4.2.4清除羥自由基能力的測(cè)定</p><p

67、>　　1mL 0.75mM 鄰二氮菲與2.0mL pH7.4 PBS 混合，再加上1mL蒸餾水，1mL 0.75mM FeSO4，1mL 0.12%H2O2，于37℃下置于暗室 60min，結(jié)果記作Ap；</p><p>　　1mL 0.75mM 鄰二氮菲與2.0mL pH 7.4 PBS混合，再加上1mL 蒸餾水，1mL 0.75mM FeSO4，1mL蒸餾水，于37℃下置于暗室60min，結(jié)果記作Ab；

68、</p><p>　　1mL 0.75mM 鄰二氮菲與 2.0mL pH 7.4 PBS混合，再加上1mL樣品，1mL 0.75mM FeSO4，1mL 0.12% H2O2，于37℃下置于暗室60min，結(jié)果記作As；</p><p>　　于536nm處測(cè)定吸光值。根據(jù)以下公式測(cè)定羥自由基清除率：</p><p>　　4.3 魚蛋白發(fā)酵液功能性</p>

69、<p>　　4.3.1發(fā)泡性測(cè)定</p><p>　　4.2mL樣品液分別調(diào)節(jié)pH為2，4，6，8，10，然后在16000rpm室溫均質(zhì)混合2min,吸收空氣，攪拌后的樣品立刻轉(zhuǎn)至10mL量筒中，30s后讀體積。體積越大說(shuō)明發(fā)泡性好；體積差越大，說(shuō)明泡持性差。根據(jù)公式[21]計(jì)算發(fā)泡能力：</p><p>　　注：A———沉淀后體積（mL）；</p><p

70、>　　B ———攪拌前體積（mL）.</p><p>　　4.3.2溶解性測(cè)定</p><p>　　量取2mL蛋白液于離心管內(nèi)，用1 or 6 N HCL 和1 or 6 N NaoH 調(diào)節(jié)pH分別為2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，置于搖床150r∕min，振蕩30min，7500rpm，離心10min，從上清液中吸取0.1mL于試管中，用蒸餾水稀釋至1mL，加5m

71、L考馬斯亮藍(lán)，搖勻，靜置5min，于595nm處測(cè)定吸光值。根據(jù)以下公式測(cè)定溶解度：</p><p>　　4.3.3乳化性測(cè)定</p><p>　　取2.7mL蛋白液，調(diào)節(jié)pH分別為2，4，6，8，10，加入0.9mL植物油，用均質(zhì)機(jī)在20000rpm均質(zhì)1min，在均質(zhì)后0min 和10min時(shí)分別從容器底部吸取50μL 乳化液,與5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS混合后測(cè)定稀釋液在 50

72、0nm處的吸光值。</p><p>　　乳化形成立刻測(cè)定的A0和乳化10min后測(cè)定的A10用計(jì)算乳化形成指數(shù)和乳化穩(wěn)定指數(shù)。計(jì)算公式[21]如下：</p><p>　　注：Δt=A0-A10, t=10min.</p><p><b>　　5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論</b></p><p>　　5.1 魚蛋白發(fā)酵液抗氧化性測(cè)定

73、</p><p>　　5.1.1 不同蛋白濃度的魚蛋白發(fā)酵液的DPPH自由基清除率</p><p>　　測(cè)定樣品在不同蛋白濃度時(shí)的清除率，分別為3.4、6.8、13.6、20.4、27.2、40.8μg/mL 。測(cè)定清除率，結(jié)果如圖1所示。</p><p>　　圖1 不同蛋白濃度的樣品DPPH自由基清除率</p><p>　　由圖1得出：蛋白

74、濃度13.6到20.4μg/mL范圍內(nèi)樣品的DPPH自由基清除率增大的幅度最大，當(dāng)樣品蛋白濃度為40.8μg/mL時(shí)，它的DPPH清除率最高，達(dá)到46.33%。對(duì)自由基起清除作用的是多肽[22]，因此，隨著樣品蛋白濃度的升高，樣品對(duì)DPPH清除率也呈遞增趨勢(shì)，高蛋白濃度的魚蛋白發(fā)酵液的DPPH自由基清除能力越強(qiáng)。</p><p>　　5.1.2不同蛋白濃度的魚蛋白發(fā)酵液的還原力</p><p&

75、gt;　　還原能力是表明物質(zhì)抗氧化性的重要指標(biāo)，也是抗氧化機(jī)理之一。作為電子供體或者氫供體，與自由基進(jìn)行反應(yīng)，使其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定物質(zhì)，終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[22]。測(cè)定樣品在不同蛋白濃度下的還原力，其數(shù)值用吸光值表示，結(jié)果見圖2。</p><p>　　圖2 不同蛋白濃度的樣品還原力</p><p>　　由圖2得出：隨著樣品蛋白濃度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)樣品蛋白濃度從40.8稀釋到27.2μg/mL時(shí)，

76、它的還原力降低幅度較大；在蛋白濃度3.4至13.6μg/mL范圍內(nèi)，蛋白濃度稀釋為原液蛋白濃度的一半時(shí)，還原力降幅較小。從圖上明顯可知，當(dāng)樣品蛋白濃度為40.8μg/mL時(shí)，它的還原力最好，吸光值達(dá)到0.190。由圖推理，蛋白濃度的高低對(duì)還原力具有一定的影響，還原力隨著蛋白濃度的升高而增強(qiáng)，高蛋白濃度的樣品的還原力充分發(fā)揮了電子供體或者氫供體的作用，消除了自由基。</p><p>　　5.1.3不同蛋白濃度的魚蛋

77、白發(fā)酵液的金屬螯合率</p><p>　　不同蛋白濃度的魚蛋白發(fā)酵液測(cè)定其金屬螯合率，螯合率用吸光度平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，測(cè)定結(jié)果如下：</p><p>　　圖3 不同蛋白濃度的樣品金屬螯合率</p><p>　　由圖3結(jié)果所示：樣品的金屬螯合率所繪圖形呈現(xiàn)拱狀，在蛋白濃度為13.6μg/mL時(shí)達(dá)到最大值，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。而樣品所含蛋白濃度為13.6μg/

78、mL時(shí)，它的金屬螯合率最高，達(dá)到12.50%。因此，由此說(shuō)明，當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?3.6μg/mL時(shí)，最能為Fe2+提供足夠的反應(yīng)底物。由于可溶性短肽生成趨于緩和，金屬螯合率逐漸呈現(xiàn)下降。</p><p>　　5.1.4不同蛋白濃度的魚蛋白發(fā)酵液的羥自由基清除率</p><p>　　所測(cè)結(jié)果如圖4所示。</p><p>　　圖4 不同蛋白濃度的樣品羥自由基清除率</

79、p><p>　　由圖4結(jié)果所示：當(dāng)樣品蛋白濃度為40.8μg/mL時(shí)，它的羥自由基清除率最高，達(dá)到14.00%。當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?.8μg/mL時(shí)，它的羥自由基清除率比蛋白濃度為3.4μg/mL時(shí)的增大2倍多。通過(guò)圖1和圖4知道，高蛋白濃度的魚蛋白發(fā)酵液對(duì)自由基清除率越更好。</p><p>　　5.2 魚蛋白發(fā)酵液功能性測(cè)定</p><p>　　5.2.1不同pH的魚蛋白

80、發(fā)酵液的發(fā)泡性</p><p>　　分別取4.2mL的魚蛋白發(fā)酵液配制成不同pH，于16000rpm均質(zhì)混合2min，于30s后測(cè)定其發(fā)泡性。測(cè)定結(jié)果如圖5所示。</p><p>　　圖5 不同pH樣品的發(fā)泡性</p><p>　　由圖5所示：圖像所示，在pH=6和10處呈現(xiàn)兩處波峰，而樣品pH調(diào)至10時(shí)，樣品的發(fā)泡性最好，達(dá)到138.10%。同時(shí)由實(shí)驗(yàn)可知，在pH

81、10時(shí)泡沫穩(wěn)定性最好，可能因?yàn)樵谶@一pH值區(qū)域泡沫破裂較緩慢，泡沫排液和pH值有關(guān)，排液速度慢，因此泡沫穩(wěn)定[21]。</p><p>　　5.2.2不同pH的魚蛋白發(fā)酵液的溶解度</p><p>　　調(diào)配成不同pH的魚蛋白發(fā)酵液，于595nm處測(cè)定其溶解度，其結(jié)果圖6。</p><p>　　圖6不同pH樣品的溶解度</p><p>　　由圖

82、6結(jié)果所示：樣品在2~12pH范圍內(nèi)，溶解度都達(dá)到60%以上。在pH2~4范圍內(nèi)，樣品溶解度呈遞增趨勢(shì)，在pH5~9范圍內(nèi)和pH10~12范圍內(nèi)也是如此。在pH10~12范圍內(nèi)溶解度的升幅較大，在pH=12達(dá)到最大溶解度96.50%。由于魚蛋白發(fā)酵液是同一溫度和蛋白濃度的情況下測(cè)定，所以影響其溶解度的因素是pH和離子強(qiáng)度，其中由于調(diào)酸調(diào)堿過(guò)程中，使用緩沖液調(diào)pH時(shí)引入了過(guò)多Na+和Cl-，從而影響了蛋白質(zhì)的溶解度，呈現(xiàn)出不規(guī)律現(xiàn)象。在酸

83、性介質(zhì)中，蛋白分子以正離子存在，電荷互相排斥，分子分散性好，溶解度高。在等電點(diǎn)時(shí)，它以兩性離子存在，溶解度降低。當(dāng)pH繼續(xù)升高時(shí)，蛋白質(zhì)變成負(fù)離子，溶解度又開始上升。</p><p>　　5.2.3不同pH的魚蛋白發(fā)酵液的乳化性</p><p>　　將魚蛋白發(fā)酵液配制成不同pH，于500nm處測(cè)定其乳化形成指數(shù)和乳化穩(wěn)定指數(shù)，測(cè)結(jié)果如圖7和圖8所示。</p><p>

84、;　　圖7不同pH樣品的乳化形成指數(shù)</p><p>　　圖8不同pH樣品的乳化穩(wěn)定指數(shù)</p><p>　　如圖7、8所示：當(dāng)樣品pH=8時(shí)，乳化形成指數(shù)最好，為3.18m²/mL，當(dāng)pH大于2后，乳化性和乳化穩(wěn)定性隨著pH的上升而下降。隨著pH的提高，蛋白質(zhì)分子上電荷（COO-）增加，分子間靜電斥力隨之增加，水化層厚度增大，乳化性及乳化穩(wěn)定性得以提高；pH大于8，蛋白質(zhì)空間結(jié)

85、構(gòu)受到破壞，或降解成小分子，蛋白質(zhì)在油-水界面上的吸附、擴(kuò)散能力降低，使乳化性和乳化穩(wěn)定性下降，乳化形成能力和乳化穩(wěn)定能力呈先增后減的趨勢(shì)[23]。</p><p><b>　　6 小結(jié)</b></p><p>　　1. 通過(guò)DPPH清除率、還原力、金屬螯合率和羥自由基清除率4項(xiàng)特性研究，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理得出以下：將樣品原液的蛋白濃度稀釋為40.8μg/mL時(shí)，樣品還原力

86、最好，吸光值可達(dá)0.190， DPPH清除率為46.33%，羥自由基清除率為14.00%。而樣品蛋白濃度為13.6μg/mL時(shí)，金屬螯合率達(dá)到最高為12.50%。</p><p>　　2. 通過(guò)發(fā)泡性、溶解性和乳化性這3項(xiàng)特性研究，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理得出以下：當(dāng)樣品pH調(diào)至10 時(shí)，發(fā)泡性達(dá)到最佳狀態(tài)為138.10%；樣品原液（pH=4.78）的溶解度用吸光值表示為0.282，當(dāng)樣品pH調(diào)成不同數(shù)值時(shí)，各pH情況下的魚

87、蛋白發(fā)酵液的溶解度用吸光值占原液吸光值的百分比來(lái)表示，經(jīng)測(cè)定pH=12狀態(tài)下的溶解度最高為96.50%；pH調(diào)至8 時(shí)，乳化形成指數(shù)EAI=3.180m²/mL，乳化穩(wěn)定指數(shù)趨于無(wú)窮大。</p><p>　　3. 通過(guò)本次研究，對(duì)于抗氧化劑的開發(fā)及其應(yīng)用前景具有重大意義，同時(shí)為其功能性開發(fā)前景提供了研究基礎(chǔ)。</p><p><b>　　[參考文獻(xiàn)]</b>

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101、Rajapakse,Eresha Mendis,Won-Kyo Jung,Jae-Young Je,Se-Kwon Kim</p><p>　　化學(xué)系，釜慶大學(xué)，599-1，Daeyon 3-dong，南區(qū)，釜山608-737，韓國(guó)</p><p>　　收到于2004年7月21日；接受于二零零四年十月三日</p><p>　　[摘要] 海洋藍(lán)貽貝(貝殼類)發(fā)酵而衍生

102、出來(lái)的肽采取凈化用離子交換，凝膠過(guò)濾和高效能的液相色譜技術(shù)來(lái)確認(rèn)強(qiáng)有力的自由基清除活性，HFGBPFH的hepta-peptide序列(MW 962 kDa)被發(fā)現(xiàn)在自由基清除上卓有成效，被命名為貽貝衍生的自由基清除肽(MRSP)。在濃度為200μg/mL的檢測(cè)條件下, MRSP可以清除過(guò)氧化物(98%)、羥基(96%),carbon-centered(91%)和DPPH激進(jìn)分子(72%)，并發(fā)現(xiàn)分別為21 ,34，52和96μM濃度時(shí)

103、的IC50值。此外,MRSP在濃度54μM時(shí)表現(xiàn)出強(qiáng)烈抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，明顯高于a-tocopherol。而且,它表現(xiàn)出95%的二價(jià)鐵的螯合效應(yīng)比檸檬酸鹽高。此外,MRSP可提高誘導(dǎo)人類細(xì)胞培養(yǎng)的氧化能力，76%證明通過(guò)濃度為75μg / mL的處理。因此,這些結(jié)果確認(rèn)了MRSP作為天然抗氧化劑通過(guò)不同的作用機(jī)制執(zhí)行它的功能。</p><p>　　[關(guān)健詞] 貽貝；發(fā)酵；自由基清除肽；抗氧化劑；脂質(zhì)過(guò)氧化作用&

104、lt;/p><p><b>　　1.引言</b></p><p>　　在有氧代謝的正常過(guò)程中，有氧生物必須解決氧序列降低產(chǎn)生的自由基。在此反應(yīng)中自由基充當(dāng)著重要的介質(zhì)，避免傳染 (Hancock，Desikan，&Neill，2001)。相反,他們或許會(huì)讓細(xì)胞損傷導(dǎo)致許多的病理學(xué)情況，包括動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、糖尿病和致癌作用，假如產(chǎn)生了不受控制的方式展現(xiàn)(Hal

105、liwell，1994)。自由基在食品產(chǎn)業(yè)中也引起了極大關(guān)注，在消費(fèi)者食品加工中也是。因?yàn)樵诩庸ず蛢?chǔ)藏過(guò)程中，脂肪中自由基介質(zhì)的氧化，還有食用油是含脂食物質(zhì)量惡化的主要原因之一。因此,過(guò)去通常合成的抗氧化劑用來(lái)解決這類問(wèn)題。然而，這些化合物必須在嚴(yán)格的規(guī)則下使用，考慮到他們可能的健康危害。</p><p>　　在過(guò)去的幾年里, 不同的氧化體系中，具有活動(dòng)性特征的無(wú)害的天然抗氧化劑作為新的產(chǎn)權(quán)已被發(fā)展并得到確認(rèn)。那

106、些抗氧化劑在自由基介質(zhì)序列氧化中發(fā)揮不同的作用原理。它們可能作為脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的抑制劑，自由基的直接清除劑和催化產(chǎn)生新自由基種類金屬離子螯合過(guò)渡的添加劑 (Vaya&Aviram，2001)。此外，從一些蛋白質(zhì)中分離出來(lái)的幾個(gè)肽序列，它們的功能作為蛋白質(zhì)抗氧化劑得到了驗(yàn)證。在我們?cè)缦鹊难芯恐?，我們?bào)道,酶解得到的凝膠和雞蛋蛋黃多肽可以表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化活性抑制脂肪酸的過(guò)氧化反應(yīng) (Kim等，2001；Park，Jung，Nam，

107、Shahidi，&Kim，2002)。另一個(gè)研究中, Suetsuna，Μkeda，and Ochi（2000）報(bào)告稱,酪蛋白得到的多肽在一些自由基類上具有清除性。除了以上，蛋白質(zhì)水解液得到的多肽也被證實(shí)具有抗氧化性和金屬螯合力 (Saiga，Tanabe，&Nishimura，2003)。</p><p>　　發(fā)酵，食品保藏的最古老的技術(shù)之一，尤其在東南亞實(shí)踐，如中國(guó)、日本和韓國(guó)認(rèn)為除了長(zhǎng)期的儲(chǔ)

108、藏性，能提高發(fā)酵食品保健價(jià)值。微生物蛋白酶對(duì)食物蛋白質(zhì)的生物活性肽產(chǎn)生分解可能的原因是發(fā)酵中類似性能的開發(fā)。因此，利益已經(jīng)發(fā)展到識(shí)別生物活性發(fā)酵食品包括魚和貝類(Ichimura，Hu，Aita，&Maruyama，2003；Kim，Chae，&In，2004；Wong&Mine,2004)健康相關(guān)的功能性如發(fā)酵食品的抗氧化性和自由基清除能力可能會(huì)存在良好的生理益處。然而，發(fā)酵食品產(chǎn)生的多肽沒(méi)有關(guān)于抗氧化性和自由

109、基清除率的信息。因此，這項(xiàng)研究是進(jìn)行確定發(fā)酵貽貝(Mytilus edulis)醬抗氧化性和自由基清除率，我們的報(bào)告結(jié)果也是第一份報(bào)告關(guān)于發(fā)酵液產(chǎn)生的自由基清除肽。而且，這份論文就肽的廣泛的抗氧化性而言描述了肽的特征。</p><p><b>　　2.實(shí)驗(yàn)材料及方法</b></p><p><b>　　2.1實(shí)驗(yàn)材料</b></p>

110、<p>　　淡菜（貽貝）購(gòu)自當(dāng)?shù)刎愵愂袌?chǎng)，Sam Chμn Po.，南韓。亞油酸，維生素E,SP-Sephadex C-25 和SephadexG-25均購(gòu)自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO.)。所有測(cè)試自由基化學(xué)試劑，包括1,1-二苯-2-苦味(DPPH),5,5-二甲基-1-吡咯啉–N氧化物(DMPO),2,20-偶氮二(2-amidinopropane)鹽酸鹽(AAPH),a-(4-吡啶-1

111、-氧化物) 亞甲基叔丁基氮氧化物(4-POBN)，也均購(gòu)自Sigma Chemical Co。從美國(guó)菌種保藏中心(Manassas,VA)購(gòu)買的人體肺成纖維細(xì)胞(ATCC CCL-75)細(xì)胞培養(yǎng)基和所有的培養(yǎng)要求的其他材料是從Gib-co BRL生命科技（美國(guó)）購(gòu)買的。其他化學(xué)用品和試劑均為分析純商用。</p><p>　　2.2貽貝發(fā)酵液的準(zhǔn)備</p><p>　　貽貝從殼中分離，在一個(gè)

112、玻璃瓶中用25%氯化鈉(v/v)發(fā)酵。6個(gè)月后，貽貝發(fā)酵液中的微生物蛋白酶在水浴鍋中加熱滅活（100℃）10min，然后通過(guò)40目篩，濾液用型號(hào)G3的微型acylizer (Asahi Kasei Inc.,Kanagawa,Japan)脫鹽。最后，脫鹽后的醬冷凍干燥，于20℃下保存，直到純化。</p><p>　　2.3氨基酸組成分析</p><p>　　貽貝的凍干發(fā)酵液（20mg）在6

113、N含0.1%乙酸的HCL中真空狀態(tài)下水解24h，苯酯分離得到的氨基酸被確定和量化使用氨基酸自動(dòng)分析儀(Biochrom 20,Pharmacia Biotech,ΜK)。</p><p>　　2.4羥自由基清除活性</p><p>　　羥自由基由Fention反應(yīng)生成(Rosen&Rauckman,1984)。肽溶液（50μL）或同等體積的磷酸鹽（pH=7.4）作為對(duì)照被添加到50

114、μL 0.3M DMPO中，50 μL 10mM硫酸亞鐵，反應(yīng)會(huì)發(fā)起的加入50μL 10mM H2O2。反應(yīng)混合物被轉(zhuǎn)移到一個(gè)密封的毛細(xì)管，DMPO- OH加合物在2.5min后使用JES-FA ESR光譜儀（日本電子，東京，日本）記錄。光譜條件控制如下：調(diào)制頻率，100千赫；微波功率，1毫瓦；微波頻率，9442兆赫；磁場(chǎng)，336.5±10mT和掃描時(shí)間，30s。</p><p>　　2.5碳為中心的自

115、由基清除活性</p><p>　　碳中心自由基產(chǎn)生于AAPH（Hiramoto，Johkoh，Sako，＆Kikugawa，1993）。20μL磷酸鹽緩沖液（PBS），AAPH（40mM），4- POBN（40mM）和肽溶液混合，在30℃下培養(yǎng)37min。反應(yīng)后，反應(yīng)混合物被轉(zhuǎn)移到一個(gè)密封毛細(xì)管和自旋加合物中記錄光譜儀的設(shè)置相同時(shí)的數(shù)據(jù)，除了上文所述微波功率（4兆瓦）。</p><p>　

116、　2.6超氧陰離子自由基清除活性</p><p>　　超氧陰離子自由基產(chǎn)生的紫外線輻照核黃素/ EDTA的系統(tǒng)（郭等，1999）。本反應(yīng)混合物含有核黃素0.3 mM，5.0 mM EDTA，0.1 M DMPO，并把不同濃度的肽含量在365nm的紫外燈下輻照1min。反應(yīng)混合物是傳送到ESR光譜儀中，使用密封毛細(xì)管和自旋加合物記錄根據(jù)上述光譜設(shè)置。</p><p>　　2.7 DPPH自由

117、基清除活性</p><p>　　測(cè)定DPPH自由基活性清除率使用的是由Nanjo等人（1996）描述的方法。60μL肽溶液于乙醇溶液中（或乙醇本身作為控制），被添加到60μL DPPH（60μmol/ L的乙醇）中漩渦混合10s。渦旋混合物填充入一密封毛細(xì)管，2min后，測(cè)定DPPH自由基自旋共振。除了微波功率（5毫瓦），光譜儀按上述相同描述設(shè)置。</p><p>　　2.8清除自由基多肽

118、純化</p><p>　　將冷凍干燥貽貝發(fā)酵醬溶解在20mM（pH=4.0）醋酸鈉緩沖液中，在轉(zhuǎn)速10,000rpm下離心10min。分離上清液使用的SP -葡聚糖的C - 25離子交換柱(直徑3.5 X 30 cm)充分平衡與相同的緩沖區(qū)。NaCl在醋酸鈉緩沖液（pH=4.0）線性梯度（0-1％，v / v）的采集維持在1mL/min和4mL組分流量。測(cè)定吸光度為215nm時(shí)的吸光值，在相同洗脫峰洗脫餾分匯集，

119、凍干及超氧陰離子自由基清除性測(cè)定。展示匯集分?jǐn)?shù)最高的自由基清除活性，溶解于蒸餾水，并裝上葡聚糖G-25凝膠過(guò)濾柱（直徑2 X 75cm）。分離獲得的蒸餾水為1mL/ min和（4mL）洗脫組分流量匯集后，在215nm處測(cè)量吸光度。最高有效部位匯集注入（直徑1 X 25cm）nucleosil 100-7 C18的色譜柱（Macherey-Nagel GmbH&Co.，Gemany）。以乙腈線性梯度的蒸餾水（0-19％v / v，

120、在40min）維持在一個(gè)流量2mL/min，分?jǐn)?shù)峰流速在215nm處收集。代表最高抗氧化性的峰值，最終純化采用Zorbax SB C18柱（直徑0.46 X25cm）色譜柱（安捷</p><p>　　2.9純化肽的分子量及氨基酸序列</p><p>　　純化的肽分子質(zhì)量測(cè)定電噴霧質(zhì)譜儀（LCQ，Thermo Finnigan，San Joes，日本）。純化肽電源注入到以下的甲醇/水（1：1

121、，v/v），分子質(zhì)量由(M+H)+離子的質(zhì)譜測(cè)定。</p><p>　　埃德曼自動(dòng)測(cè)序是由使用自動(dòng)蛋白質(zhì)測(cè)序儀的上線配備高效液相色譜法，以確定純化的多肽氨基酸序列的標(biāo)準(zhǔn)程序。</p><p>　　2.10評(píng)估脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)抗氧化性的抑制作用</p><p>　　亞油酸是亞油酸氧化模型中系統(tǒng)測(cè)量的抗氧化活性，采用玻片法和并木的大澤（1985）修改幻燈片。略論，肽樣品溶解

122、于5mL 50mM磷酸鹽緩沖液（pH=7.0），并與99.5％乙醇（5mL）和亞油酸混合物（0.065mL）混合，其中最后的體積調(diào)整到12.5 mL蒸餾水。一次實(shí)驗(yàn)中，樣品換成了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的抗氧化劑的A -維生素E作為一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照?；旌先芤涸谝粋€(gè)稍微密封的旋蓋錐形管于暗室中40℃培養(yǎng)，根據(jù)Mitsuda,Yasumoto,and Iwami的方法，用硫氰酸鐵法間隔24h衡量亞油酸氧化的程度。</p><p>　　2

123、.11金屬螯合力的測(cè)定</p><p>　　利用Decker和Welch（1990）方法對(duì)勝肽螯合亞鐵離子能力進(jìn)行了評(píng)估。1mL肽溶液毫升首先混合3.7mL蒸餾水，然后混合0.1mLFeCl2和0.2 mL 5mM 3 -（2 - 吡啶基）-5,6 -二（4 -苯基磺酸）-1,2,4三嗪（Ferrozine），經(jīng)過(guò)10min。，反應(yīng)混合物的光密度在于562 nm下測(cè)定，螯合力以百分比計(jì)算{1-（樣品在562nm時(shí)

124、吸光度）/（控制吸光度=562nm）} X 100。</p><p>　　2.12純化肽對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞氧化能力的影響</p><p>　　人肺成纖維細(xì)胞（ATCCCCL- 75）是使用Dulbecco的改良培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)液）在一個(gè)飽和濕度培養(yǎng)（5％二氧化碳，37℃），10％胎牛血清，1mM谷氨酰胺和100L/mL青霉素每三天更新培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)四個(gè)階段后，采用MTT（3 -（4,5 -二 甲

125、基- 2 -基）-2,5 - diphenyltetrazolium溴）的方法（漢森，尼爾森，與伯格，1989）來(lái)測(cè)定細(xì)胞存活率，通過(guò)評(píng)估能力的琥珀酸脫氫酶轉(zhuǎn)換3 -（4,5 -二甲基噻唑- 2-基）-2,5 - diphenyltetrazolium溴成可見甲臜結(jié)晶。對(duì)于MTT法，細(xì)胞以細(xì)胞濃度為10000個(gè)/孔接種在96孔板，培養(yǎng)16h。然后培養(yǎng)細(xì)胞用不同濃度的純化肽（15,45,75,100和125 μmol）進(jìn)行處理，另外培養(yǎng)1

126、6 h。繼胎牛血清去除，細(xì)胞暴露在200umol t-BHP中2h，對(duì)于每個(gè)孔，250μL的MTT（0.5mg/mL的最終濃度）加入并溶解于培養(yǎng)液，在黑暗中培養(yǎng)（37℃）1 h。最后，二甲基亞砜（250μL）加入溶解形成甲臜。形成的甲臜量測(cè)定光密度使用Emax的酶標(biāo)儀（Molecμlar Device</p><p><b>　　2.13統(tǒng)計(jì)資料</b></p><p&g

127、t;　　結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差平均（3例）。學(xué)生的t -檢驗(yàn)來(lái)確定的水平具有重要意義</p><p><b>　　3.結(jié)果與討論</b></p><p>　　3.1貽貝發(fā)酵液的自由基清除活性</p><p>　　海洋藍(lán)貽貝（貽貝）進(jìn)行發(fā)酵6個(gè)月，它通過(guò)電子自旋捕獲技術(shù)能夠清除羥基，超氧化物，DPPH自由基和碳為中心的自由基。貽貝汁發(fā)酵

128、產(chǎn)生不同的測(cè)試自由基清除力，并表示為清除力百分比，控制ESR信號(hào)強(qiáng)度（圖1）。濃度為0.2mg/ mL的貽貝醬，對(duì)超氧陰離子劑DMPO自旋系統(tǒng)產(chǎn)生的照射核黃素系統(tǒng)的抑制率為為41.3 ± 0.54％。與在相同濃度的貽貝醬相比，利用芬頓反應(yīng)生成的氫氧自由基和典型 1:2:2:1的DMPO - OH加合物劑的ESR信號(hào)也壓抑在一個(gè)較高的百分比（40.1 ± 0.76％）。高貽貝清除羥自由基的活性更高可能因?yàn)閹缀跛械挠袡C(jī)

129、分子，包括肽羥自由基氧化反應(yīng)極易發(fā)生。此外，這種更高的活性也可能是由于二價(jià)鐵的螯合作用，阻礙通過(guò)Fenton反應(yīng)羥自由基的生成。因此，清除超氧自由基的活性更好地體現(xiàn)了貽貝自由基清除能力醬相比，而且，貽貝汁可以減少AAPH和DPPH自由基產(chǎn)生的4-POBN 35.4± 0.87％到22.6 ± 0.39％。此外，增加濃度貽貝汁呈現(xiàn)在所有四個(gè)自由基清除活性呈劑量依賴性（未顯示）。</p><p>

130、<b>　　圖1</b></p><p>　　貽貝醬氨基酸組成顯示，它的氨基酸含量豐富，谷氨酸（17.28％w/w），甘氨酸（16.91％），天門冬氨酸（9.41％），亮氨酸 （8.48％），丙氨酸（8.25％），脯氨酸（5.87％）和異亮氨酸（5.11％）（見表1）。來(lái)源于一些蛋白質(zhì)的肽具有增加疏水性的報(bào)道（Chen，Muramoto，&Yamauchi，1995）。因此，有人推測(cè)

131、，貽貝醬中產(chǎn)生的肽序列如亮氨酸、纈氨酸和丙氨酸的疏水性更顯著。而且，據(jù)報(bào)道這些氨基酸在中亞油酸的模型系統(tǒng)（Marcuse，1962）測(cè)定能有效抑制氧化清除自由基。此外，一個(gè)肽氨基酸序列是其抗氧化活性的重要定位，據(jù)稱谷氨酸和亮氨酸在抗氧化肽序列上提高清除自由基能力，氧化肽序列（Chen，Muramoto，Yamauchi，&Nokihara，1996；Suetsuna 等，2000）。因此，推定貽貝發(fā)酵液的自由基清除力是由于發(fā)酵過(guò)

132、程中產(chǎn)生的一些肽物理特性。</p><p>　　3.2自由基清除肽純化</p><p>　　貽貝發(fā)酵液利用強(qiáng)大的凈化清除自由基，在每個(gè)凈化階段對(duì)超氧肽序列自由基清除活性進(jìn)行了測(cè)試。第一凈化時(shí)，原油分餾醬離子用SP-葡聚糖的C-25柱交換層進(jìn)行分餾離子交換層析，10.3％的材料采用回收與成三分離峰相同的流量，如圖2（a）所示。束縛化合物（89.7％）以氯化鈉（0-1 M）的線性梯度洗脫組分為

133、四個(gè)不同的分?jǐn)?shù)（D-G）。觀察到一個(gè)明顯的差別約束和非約束之間組分，組分F為更有力清除超氧自由基。組分F應(yīng)用到Sephadex G - 25凝膠過(guò)濾柱，再用蒸餾水洗脫。第三部分池（F3，組分67-72），其中第四組分結(jié)果顯示超氧陰離子自由基的清除活性最高（圖2（b））。如表2所示，凝膠色譜層析觀察發(fā)現(xiàn)首先在凈化離子交換柱可能導(dǎo)致自由基清除活性更高。組分池的分?jǐn)?shù)由凝膠過(guò)濾層析分離得到進(jìn)一步半制備色譜柱C18的不同分為八峰（圖2（c））。洗

134、脫峰F3b，F(xiàn)3d和F3e有較高的活性，以清除超氧自由基和最有力的F3d峰最終被C18柱純化，分析色譜柱為單一肽（圖2（d）段），產(chǎn)生一個(gè)整體純化倍數(shù)的14.6％。純化肽被命名為貽貝源性自由基清除肽（MRSP）。</p><p>　　MRSP的分子質(zhì)量（962Da）由電噴霧質(zhì)譜在良好的協(xié)議與理論計(jì)算的質(zhì)量從序列確定。純化的多肽由七個(gè)氨基酸序列確定的順序是組氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-組氨酸（HFG

135、BPFH）。此外，氨基酸殘基在目前這種肽序列以及對(duì)應(yīng)肽與其他抗氧化劑的字符。</p><p>　　3.3 MRSP的自由基清除力</p><p>　　純化的多肽（P＜0.01）在濃度為200 μg/ mL時(shí)對(duì)超氧化物（98％）清除具有重要效力，羥自由基清除效力（96％），碳中心的（91％）和DPPH（72％）自由基。超氧化物歧化酶和MRSP的羥自由基清除活性約是一般自由基清除劑維生素E的兩

136、倍（數(shù)據(jù)未顯示）。這種肽的IC50值的清除超氧陰離子自由基是21 μmol。通過(guò)清除作用劑DMPO - OOH的典型ESR譜自旋加合物測(cè)定，歸因于能力的肽反應(yīng)與超氧離子比DMPO高。羥基的IC50值結(jié)果顯示，碳為中心，DPPH自由基分別是34,52和96μmol。肽包含兩個(gè)芳香族氨基酸和兩個(gè)組氨酸殘基，是使自由基清除力更高的原因。一般來(lái)說(shuō)，芳香族氨基酸被認(rèn)為是有效的自由基清除劑，因?yàn)樗麄兛梢酝瑫r(shí)通過(guò)共振結(jié)構(gòu)維持其穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，輕松地提供質(zhì)子