沒食子酸納米硒抗氧化性的測定-食品質(zhì)量與安全畢業(yè)論文

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　沒食子酸納米硒抗氧化性的測定</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 食品質(zhì)量與安全

2、 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄</b>

3、</p><p><b>　　摘 要I</b></p><p>　　AbstractII</p><p><b>　　引 言III</b></p><p>　　1 材料與方法- 1 -</p><p>　　1.1 實(shí)驗(yàn)材料- 1 -</p>&

4、lt;p>　　1.1.1 主要原料- 1 -</p><p>　　1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑- 1 -</p><p>　　1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備- 1 -</p><p>　　1.1.4 試劑的配置- 2 -</p><p>　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法- 2 -</p><p>　　1.2.1

5、 清除羥基自由基的測定- 2 -</p><p>　　1.2.1.1 實(shí)驗(yàn)原理- 2 -</p><p>　　1.2.1.2 實(shí)驗(yàn)步驟[9-11]- 2 -</p><p>　　1.2.2 ABTS+自由基清除能力的測定- 3 -</p><p>　　1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)原理- 3 -</p><p&g

6、t;　　1.2.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟[12-13]- 3 -</p><p>　　1.2.3 還原力的測定- 3 -</p><p>　　1.2.3.1 實(shí)驗(yàn)原理- 3 -</p><p>　　1.2.3.2 實(shí)驗(yàn)步驟[14-15]- 4 -</p><p>　　2 結(jié)果與分析- 4 -</p><p>

7、;　　2.1 GA@SeNPs對(duì)體外羥基自由基的清除率分析- 4 -</p><p>　　2.2 GA@SeNPs對(duì)體外ABTS+自由基清除率分析- 5 -</p><p>　　2.3 GA@SeNPs的總還原力測定分析- 5 -</p><p>　　3 小結(jié)與討論- 6 -</p><p>　　參 考 文 獻(xiàn)- 7 -&l

8、t;/p><p>　　致 謝- 8 -</p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　本文通過采用分光光度法對(duì)沒食子酸納米硒（GA@SeNPs）體外清除羥基自由基、ABTS+自由基和還原力進(jìn)行測定，評(píng)價(jià)其抗氧化性。結(jié)果表明，與沒食子酸（Gallic acid,GA）、維生素C(Vc)相比，100-300 μg/mL的GA

9、@SeNPs對(duì)羥基自由基的清除率為49.90%-96.86%，其清除率高于同等濃度下的Vc及GA；5-25 μg/mL的GA@SeNPs對(duì)ABTS+自由基的清除率47.02%-97.57%，其清除率高于同等濃度下的Vc及GA；20-100 μg/mL的GA@SeNPs對(duì)還原力的測定吸光度為0.362-0.911，在同等濃度下其還原力大于Vc，略低于GA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GA@SeNPs具有較強(qiáng)的抗氧化活性。</p><

10、p>　　關(guān)鍵詞：沒食子酸納米硒；抗氧化；自由基；清除率；還原力</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　In this paper, the antioxidation of GA@SeNPs to hydroxyl free radicals, ABTS+ free radicals and reductive forces

11、in vitro was determined by spectrophotometry with the Spectrophotometric method. The results showed that compared with Gallic acid (Gallic acid,GA) and Vitamin C(Vc), 100-300 μg/mL GA@SeNPs to hydroxyl radical scavenging

12、 rate of 49.90%-96.86%, its scavenging rate is higher than that the same concentration of Vc and GA; 5-25 μg/mLGA@SeNPs to ABTS+ free radicals scavenging rate 47.02%-9</p><p>　　Key words:gallic acid modified

13、 selenium nanoparticles; anti-oxidant; free radical; scavenging rate; reducing power</p><p><b>　　引 言</b></p><p>　　沒食子酸(Gallic acid,GA),化學(xué)名3,4,5-三羥基苯甲酸,是一種天然的多酚類化物,廣泛存在于中草藥和水果類植物中,包括

14、葉下珠、五倍子、余甘子、葡萄、甜茶、報(bào)春黃甙葉等提取物[1]。沒食子酸具有抗炎、抗突變、抗氧化、抗腫瘤、抗自由基等多種生物活性,在食品、生物、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[2-3]。</p><p>　　硒是動(dòng)物和人體健康生長發(fā)育所必需的微量元素[4]。納米硒是納米級(jí)的單質(zhì)硒[5]。硒的缺乏還會(huì)嚴(yán)重影響機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)，造成對(duì)細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和DNA的損傷，進(jìn)而干擾各類激素、生長因子和細(xì)胞活性素在體內(nèi)執(zhí)行的各項(xiàng)功能

15、[6]。長期以來，關(guān)于硒的報(bào)道主要集中在納米硒源和無機(jī)硒源作用比較和劑量確定上，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)了納米硒比無機(jī)硒毒性作用低，生物轉(zhuǎn)化率高[7]。</p><p>　　GA@SeNPs 具有較好的穩(wěn)定性，然而對(duì)GA@SeNPs 的抗氧化能力的評(píng)價(jià)還未見報(bào)道，對(duì)此本文選用GA@SeNPs作為研究對(duì)象，特別針對(duì)其體外其體外對(duì)各種自由基 (羥基自由基、ABTS+自由基及還原力的測定)的清除效果進(jìn)行考察，并與Vc 這個(gè)公認(rèn)的自

16、由基清除劑和GA做對(duì)比研究，評(píng)估GA@SeNPs的抗氧化能力，以期為GA@SeNPs抗氧化作用在食品保鮮、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域提供理論依據(jù)。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p><b>　　1.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　　1.1.1 主要原料</p><

17、p>　　GA@Se溶膠的制備參考已發(fā)表的文獻(xiàn)進(jìn)行GA@Se的合成制備[8]。稱取0.19 g沒食子酸至250 mL燒杯中，用蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶并用蒸餾水定容，配成0.01 mol/L的沒食子酸儲(chǔ)備液。稱取0.17 g亞硒酸鈉至50 mL燒杯中，用蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶并用蒸餾水定容，配成0.1 mol/L的亞硒酸鈉儲(chǔ)備液。然后在25 mL燒杯中按1：6的濃度加入Na2SeO3與沒食子酸，利用鹽酸將pH

18、調(diào)至3.0后，加熱揮干后得到橙紅色固相樣品。將此樣品加蒸餾水溶解，在透析袋中過夜透析除去未反應(yīng)的沒食子酸后，定容于10 mL容量瓶中得到GA@Se溶膠。 </p><p>　　1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑</p><p>　　1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備</p><p>　　1.1.4 試劑的配置</p><p>　　6 mol/

19、L綠礬（FeSO4.7H2O):稱取0.17 g綠礬溶于燒杯中，并用蒸餾水定容于100 mL容量瓶中搖勻。 </p><p>　　6 mol/L雙氧水(H2O2):稱取0.07 g30%的雙氧水用蒸餾水定容于100 mL容量瓶中搖勻。 </p><p>　　6 mol/L水楊酸(C7H6O3)：

20、稱取0.08 g水楊酸用無水乙醇溶解于燒杯中，并用無水乙醇定容于100 mL容量瓶中。 </p><p>　　1 mg/mL過硫酸鉀：稱取0.10 g過硫酸鉀于燒杯中，用蒸餾水定容于100 mL的容量瓶中。 </p><p>　　80%的乙醇：取40 mL無水乙醇加入到50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。</p><p>

21、　　ABTS工作液：精密稱取40 mgABTS，加入1 mg/mL的過硫酸鉀溶液8 mL，密封后避光靜置反應(yīng)16 h，定量轉(zhuǎn)移到250 ml的容量瓶中，加入32 mL蒸餾水，用無水乙醇定容至刻度，放置10 h后使用。</p><p>　　0.20 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=6.6）：甲液（磷酸氫二鈉十二結(jié)合水），稱取7.16 g溶于燒杯中，用蒸餾水定容于100 mL的容量瓶中；乙液（磷酸二氫鈉二結(jié)合水），稱取

22、3.12 g溶于燒杯中，用蒸餾水定容于100 mL的容量瓶中。取40 mL甲液，60 mL乙液混合，即配置成所需的0.20 mol/L磷酸鹽緩沖液。</p><p>　　1%鐵氰化鉀:稱取1 g鐵氰化鉀溶于燒杯中，加蒸餾水定容于100 mL的容量瓶中。</p><p>　　0.1%三氯化鐵:稱取0.10 g的三氯化鐵溶于燒杯中，用蒸餾水定容于100 mL的容量瓶中。</p>

23、<p>　　10%三氯乙酸:稱取10 g三氯乙酸溶于燒杯中，用蒸餾水定容于100 mL的容量瓶中。</p><p><b>　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　1.2.1 清除羥基自由基的測定</p><p>　　1.2.1.1 實(shí)驗(yàn)原理</p><p>　　根據(jù)Fenton方法產(chǎn)生?OH自

24、由基的模型，H2O2與亞鐵離子反應(yīng)生成?OH自由基,該反應(yīng)為：H2O2+Fe2+→?OH+?OH+Fe3+</p><p>　　自由基一般存活時(shí)間比較短而且具有較高活性的特點(diǎn)，而水楊酸能有效地捕捉羥基自由基且產(chǎn)生有色產(chǎn)物，因此，若在該體系加入一定量的水楊酸，將發(fā)生顏色反應(yīng)。生成的有色產(chǎn)物在510 nm處被較強(qiáng)地吸收。</p><p>　　1.2.1.2 實(shí)驗(yàn)步驟[9-11]</p&

25、gt;<p>　　（1）各取1 mL的0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25 mg/mL、0.30 mg/mL</p><p>　　的樣品溶液于5支離心管中，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液1 mL，6 mol/L H2O21 mL，混勻后靜置10 min，再加入6 mol/L水楊酸溶液1 mL混勻后靜置30 min，然后于510 nm處測其吸光度值A(chǔ)i。

26、在其他處理不變的情況下，以1 mL蒸餾水代替水楊酸測吸光度Aj，空白對(duì)照組以1 mL蒸餾水代替樣品溶液測吸光度A0。羥基自由基的清除率計(jì)算公式：</p><p>　　E=(A0—Ai+Aj)/A0</p><p>　　（2）以樣品濃度為橫坐標(biāo)，羥自由基清除率為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出他們之間的關(guān)系。</p><p>　　1.2.2 ABTS+自由基清除能力的測定&

27、lt;/p><p>　　1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)原理</p><p>　　ABTS法是使用最廣泛的間接檢測方法，可用于親水性和親脂性物質(zhì)抗氧化能力測定。ABTS經(jīng)氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子自由基ABTS+，能溶于水相或酸性乙醇介質(zhì)中，在734 nm處有最大吸收。被測物質(zhì)加入ABTS+溶液后，所含抗氧化成分能與ABTS+發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色，在ABTS+的最大吸收波長（一般選擇734 nm）

28、檢測吸光度的變化。</p><p>　　1.2.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟[12-13]</p><p>　?。?）各取0.50 mL的0.005 mg/mL、0.010 mg/mL、0.015 mg/mL、0.020 mg/mL、0.025 mg/mL的樣品溶液于5支離心管中，用80%乙醇補(bǔ)至2 mL，再加入2 mLABTS+工作液，搖勻，避光反應(yīng)6 min，然后在734 nm下測吸光值A(chǔ)i，在

29、其他處理不變的情況下，以80%乙醇代替樣品溶液作為空白對(duì)照，測吸光度A0。計(jì)算提取液對(duì)ABTS+自由基清除率:</p><p>　　W=(A0—Ai)/A0</p><p>　?。?）以樣品濃度為橫坐標(biāo)，ABTS+自由基清除率為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出他們之間的關(guān)系。</p><p>　　1.2.3 還原力的測定</p><p>　　1.2

30、.3.1 實(shí)驗(yàn)原理</p><p>　　K3Fe(CN)6 (赤血鹽）+樣品→K4Fe(CN)6(黃血鹽）+樣品氧化物 </p><p>　　K4Fe(CN)6+Fe3+→Fe4[Fe(CN)6]3（普魯士藍(lán)）</p><p>　　普魯士藍(lán)為沉淀，700 nm是普魯士藍(lán)的最大吸收，在波長700 nm處測吸光度Ai，Ai越大，還原力越大。</p>&

31、lt;p>　　1.2.3.2 實(shí)驗(yàn)步驟[14-15]</p><p>　　（1）各取1 mL的0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL</p><p>　　的樣品溶液于5支離心管中，加入0.20 mol/L磷酸鹽緩沖液1.25 mL（PH=6.6）和1%的鐵氰化鉀溶液1.25 mL，混勻后于50 ℃水浴中保溫20

32、min后，快速冷卻，再加入1 mL10%三氯乙酸，以3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液0.50 mL,加入0.1%三氯化鐵溶液0.25 mL，再加入1.75 mL蒸餾水，充分混勻，在700 nm處測定其吸光值A(chǔ)i。</p><p>　?。?）以樣品濃度為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)i為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出他們之間的關(guān)系。</p><p><b>　　2 結(jié)果與分析&l

33、t;/b></p><p>　　2.1 GA@SeNPs對(duì)體外羥基自由基的清除率分析</p><p>　　圖1 羥基自由基的測定</p><p>　　GA@SeNPs對(duì)羥基自由基清除效果由圖1所示，100,150,200,250,300 μg/mL的</p><p>　　GA@SeNPs對(duì)羥自由基清除率分別為：49.90%、83.42

34、%、91.35%、93.36%、96.68%。并呈現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系，而Vc在相同濃度下的清除率分別為：40.42%、51.29%、52.94%、53.09%、53.20%,GA的清除率分別為：50.72%、62.82%、82.03%、90.58%、</p><p>　　93.41%。結(jié)果表明Vc清除率較低，GA@SeNP在相同濃度下對(duì)羥自由基清除率優(yōu)于Vc和GA,最高清除率可達(dá)96.68%。</p&g

35、t;<p>　　2.2 GA@SeNPs對(duì)體外ABTS+自由基清除率分析</p><p>　　ABTS[2,2’—聯(lián)氨—雙（3—乙基苯并噻唑咻—6—磺酸）二胺）是一種供氫體。該方法作為測定抗氧化性的一種新方法，以Vc為陽性對(duì)照，測定其清除率如圖2所示。</p><p>　　圖2 ABTS+自由基清除率的測定</p><p>　　由圖2可以看出，GA@

36、SeNPs對(duì)ABTS+自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增大，并呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí)，GA@SeNPs的清除率為97.57%，GA的清除率為95.39%，而Vc的清除率只有32.48%，可見GA@SeNPs對(duì)ABTS+自由基具有極強(qiáng)的清除能力。</p><p>　　2.3 GA@SeNPs的總還原力測定分析</p><p>　　抗氧化劑的還原力與其抗氧化活性之

37、間存在關(guān)系，還原力越強(qiáng)，抗氧化活性越強(qiáng)。FeCl3/K3Fe(CN)6 法測定還原力，是通過測普魯士藍(lán)沉淀在700 nm處的吸光度，而離心之后普魯士藍(lán)還沒有沉淀下去時(shí)測其吸光度，吸光度處于不斷變化之中，所以測量應(yīng)先搖晃均勻放進(jìn)去立馬記錄數(shù)據(jù)。 </p><p><b>　　圖3 還原力的測定</b></p><p>　　由圖3可以看出，GA@SeNPs對(duì)普魯士藍(lán)的還

38、原作用曲線大致呈線性關(guān)系，且基本與Vc的曲線平行，直到質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)兩條曲線呈現(xiàn)遠(yuǎn)離趨勢，GA@SeNPs的還原作用在加快，而Vc的則在放緩。GA的還原作用則在質(zhì)量濃度為80 μg/mL之后優(yōu)于GA@SeNPs和Vc。說明GA@SeNPs的還原力比Vc強(qiáng)，抗氧化性比Vc強(qiáng)。</p><p><b>　　3 小結(jié)與討論</b></p><p>　　抗氧

39、化劑是指能防止或延緩食品氧化性和延長貯存期的食品添加劑。GA@SeNPs則是外界物質(zhì)通過人為化學(xué)合成的一種抗氧化性納米材料。</p><p>　　對(duì)于羥基自由基的清除作用：GA@SeNPs、GA、Vc對(duì)羥基自由基的清除率都是隨著濃度的增大，清除率增大。濃度范圍在100-300 μg/mL時(shí)對(duì)羥基自由基的清除能力：GA@SeNPs＞GA＞Vc。</p><p>　　對(duì)于ABTS+自由基的清除

40、作用：GA@SeNPs、GA、Vc對(duì)ABTS+自由基的清除率都是隨著濃度的增大，清除率增大。濃度范圍在5-25 μg/mL時(shí)對(duì)ABTS+自由基的清除能力：GA@SeNPs＞GA＞Vc。</p><p>　　對(duì)于還原力的測定：GA@SeNPs、GA、Vc的還原力都是隨著濃度的增大，還原力逐漸增強(qiáng)。濃度范圍在20-100 μg/mL時(shí)還原力大?。篏A＞GA@SeNPs＞Vc。</p><p>

41、　　綜上所述，GA@SeNPs具有很強(qiáng)的抗氧化性，可應(yīng)用食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域，具有廣闊的發(fā)展前景。</p><p><b>　　參 考 文 獻(xiàn)</b></p><p>　　[1]何文飛, 何大維, 馬超, 等. 沒食子酸抑制人神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, (02):107-110.</p><p>

42、　　[2]李肖玲, 崔嵐, 祝秋德. 沒食子酸生物學(xué)作用的研究進(jìn)展[J]. 中國藥師, 2004, 7(10):767-769.</p><p>　　[3]Ohno T, Inoue M, Ogihara Y. Cytotoxic activity of gallic acid against liver metastasis of mastocytoma cells P-815[J]. Anticancer r

43、esearch, 2001, 21(6A):3875.</p><p>　　[4]楊清麗, 陳繼發(fā), 曲湘勇, 等. 納米硒對(duì)蛋鴿生產(chǎn)性能、蛋中硒含量及血清抗氧化指標(biāo)的影響[J]. 動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào), 2015, 27(12):3895-3903.</p><p>　　[5]陳劍杰, 曹謹(jǐn)玲, 羅永巨, 等. 納米硒對(duì)氟脅迫下鯉魚肝抗氧化功能及組織結(jié)構(gòu)的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2013,

44、 24(10):2970-2976.</p><p>　　[6]Surai P F, Surai P F. Selenium in nutrition and health.[J]. Selenium in Nutrition & Health, 2006.</p><p>　　[7]Gunter S A, Beck P A, Phillips J K. Effects of su

45、pplementary selenium source on the performance and blood measurements in beef cows and their calves[J]. Journal of Animal Science, 2003, 81(4):856-864.</p><p>　　[8]鐘彩玲. 納米硒界面對(duì)草酸鈣晶體生長的調(diào)控作用[D]. 暨南大學(xué), 2014.<

46、/p><p>　　[9]徐建國, 胡青平. 決明子水提物體清除自由基活性的研究[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(6)73-7.</p><p>　　[10]Xu X, Wang W, Li H. Determination of hydroxyl radicals in Fenton reaction by colorimetric assay and its application[J

47、]. Progress in Biochemistry & Biophysics, 1999, 26(1):67-69.</p><p>　　[11]Jia Z, Wu J, Tang M. Colorimetric determination of hydroxyl radicals from fenton reaction[J]. Progress in Biochemistry & Biop

48、hysics, 1996, 23(2):184-186.</p><p>　　[12]Binsan W, Benjakul S, Visessanguan W, et al. Antioxidative activity of Mungoong, an extract paste, from the cephalothorax of white shrimp (Litopenaeus vannamei)[J].

49、Food Chemistry, 2008, 106(1):185-193.</p><p>　　[13]Re R, Pellegrini N, Proteggente A, et al. Antioxidant activity applying a improved abts radical cation assay[J]. Free Radical Biology & Medicine, 1999,

50、26(9-10).</p><p>　　[14]Amarowicz R, Estrella I, Hernández T, et al. Free radical-scavenging capacity, antioxidant activity, and phenolic composition of green lentil ( Lens culinaris )[J]. Food Chemistry

51、, 2010, 121(3):705-711.</p><p>　　[15]Kumaran A, Karunakaran R J. Antioxidant and free radical scavenging activity of an aqueous extract of Coleus aromaticus.[J]. Food Chemistry, 2006, 97(1):109-114.</p>

52、;<p><b>　　致 謝</b></p><p>　　匆匆四年，轉(zhuǎn)眼大學(xué)生活即將進(jìn)入尾聲，同學(xué)們也都相繼完成了自己的畢業(yè)論文，完成了自己的學(xué)習(xí)任務(wù)，即將步入社會(huì)。而我的畢業(yè)論文也即將完成了。四年的大學(xué)生活，讓我在環(huán)境優(yōu)美、人文優(yōu)雅的江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，我感到十分感激，感謝江西農(nóng)業(yè)大學(xué)對(duì)我的教育和栽培。</p><p>　　首先，我要感謝我的畢業(yè)論文指

53、導(dǎo)老師楊老師。楊老師待人隨和，從論文的選題和試劑的準(zhǔn)備及實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，楊老師給了我許多幫助和意見。 雖然在1個(gè)多月的實(shí)驗(yàn)中，遇到過許多挫折，但是都在老師的幫助下一項(xiàng)項(xiàng)解決了。不斷的改正和重新實(shí)驗(yàn)，在楊老師的指導(dǎo)下讓我在實(shí)驗(yàn)室學(xué)到了許多實(shí)驗(yàn)技能，并且順利得完成實(shí)驗(yàn)，再次感謝楊老師。</p><p>　　其次，感謝師兄師姐的熱心幫忙，很多儀器和試劑多虧了師兄師姐的幫忙我才找到，實(shí)驗(yàn)室沒有的話還幫我向其他師兄師姐借了一些