醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

1、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案：,6．參考文獻(xiàn),,一、實(shí)驗(yàn)名稱 ：,二、總體設(shè)計(jì)思路：,三、具體設(shè)計(jì)方案：,1．實(shí)驗(yàn)?zāi)康?,2．實(shí)驗(yàn)原理,3．實(shí)驗(yàn)材料、試劑及器材,4．實(shí)驗(yàn)方法及注意事項(xiàng),5．實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果及遺傳指導(dǎo),一、實(shí)驗(yàn)名稱 ：,從孕婦外周血中提取胎兒DNA進(jìn)行a地貧的產(chǎn)前診斷,二、總體設(shè)計(jì)思路：,抽取孕婦外周血 → 提取胎兒DNA → 利用 PCR技術(shù)進(jìn)行胎兒DNA擴(kuò)增 → 利用Sou-thern分子印跡雜

2、交法檢測(cè)出限制性片段長(zhǎng) 度多態(tài)性（RFLP）進(jìn)行基因診斷【用DNA限制酶處理擴(kuò)增產(chǎn)物 → 瓊脂糖凝膠電泳 → 轉(zhuǎn)膜 →探針標(biāo)記 → 預(yù)雜交 → Southern雜交 → 洗膜 → 放射性自顯影檢測(cè)】,三、具體設(shè)計(jì)方案：,1．實(shí)驗(yàn)?zāi)康睦迷袐D外周血中游離的胎兒DNA進(jìn)行a地貧的產(chǎn)前診斷，從而進(jìn)行遺傳指導(dǎo)。 2．實(shí)驗(yàn)原理：地中海貧血的分布遍及全世界，我國(guó)南方省區(qū)的發(fā)病率也較高，如廣西壯族自治區(qū)可高達(dá)14.6%，其次為廣東、海南、云

3、南等。在遺傳咨詢的基礎(chǔ)上，對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)的胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷和選擇性終止妊娠是防止遺傳病、先天畸形患兒出生的最有效而可行的方法，對(duì)于減少群體中致病基因頻率和提高人口素質(zhì)具有十分重要的意義。,傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷方法一般采用羊膜腔穿刺、絨毛膜取樣和臍靜脈穿刺等，它們都具有創(chuàng)傷性，可能對(duì)孕婦及胎兒造成一定危害，如宮內(nèi)感染、出血甚至流產(chǎn)、死胎等。利用孕婦外周血中游離的胎兒DNA進(jìn)行產(chǎn)前診斷是一項(xiàng)非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷技術(shù)，易于被孕婦接受。孕婦外周血中游離的胎兒D

4、NA含量相對(duì)高，提取及分析過(guò)程簡(jiǎn)單，易于發(fā)展為可應(yīng)用于臨床的大樣本高通量的檢測(cè)方法。另外胎兒DNA在孕早期就可檢測(cè)到，且分娩后很快被清除，不會(huì)受前次妊娠的影響。,PCR技術(shù)能在體外快速簡(jiǎn)便地?cái)U(kuò)增特異的DNA片段，為基因診斷分析提供了方便，被廣泛運(yùn)用于遺傳病和腫瘤的基因診斷。若PCR產(chǎn)物的片段中包含有RFLP的切點(diǎn)，則可將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用相應(yīng)的限制酶處理，經(jīng)電泳后檢測(cè)其多態(tài)性，結(jié)合系譜進(jìn)行分析，可進(jìn)行基因診斷。,Southern分子印跡雜

5、交是將酶解后的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，然后經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和，高鹽下通過(guò)吸附作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上，附著在濾膜上的DNA與32p標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影技術(shù)確定探針互補(bǔ)的每條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。此法可檢測(cè)出限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP），從而進(jìn)行基因診斷。,3．實(shí)驗(yàn)材料、試劑及器材 3.1 材料： 孕婦的新鮮外周血5 m

6、l、瓊脂糖凝 膠（新制備）、硝酸纖維素濾膜（NC膜）、透明膠帶、防護(hù)眼鏡、塑料瓶、塑料袋、保鮮膜、濾紙、X光底片3.2 試劑： EDTA（乙二胺四乙酸）鹽抗凝劑，0．12 ml 10% 的中性buffer溶液(含4 %的甲醛)，QIAamp DNA提取試劑盒(Qiagen)；Taq酶(Takara)，雙蒸水， PCR緩沖液， dNTP (Promega)， AmpF1STR@擴(kuò)增試劑盒(ABI)；BamHI內(nèi)切酶，DNA上

7、樣緩沖液，放射性物質(zhì)（32p），變性液，預(yù)雜交液，2×SSC（50%甲酰胺），X光片沖洗液。,3.3 主要儀器： 離心機(jī)，冰箱，基因擴(kuò)增儀、微量移液槍(20μl)，電泳儀，紫外透射儀，封口器，southern印跡雜交實(shí)驗(yàn)儀器，水浴鍋（0℃，42℃，100℃），瓊脂糖平板電泳裝置，放射性檢測(cè)儀，暗盒（加雙側(cè)增感屏）,4．實(shí)驗(yàn)方法及注意事項(xiàng)4.1 方法步驟：4.1.1 血漿制備： 抽取孕婦外周血5 ml，加入E

8、DTA抗凝劑，0．12 ml 10% 的中性buffer溶液(含4 %的甲醛)進(jìn)行預(yù)處理。4.1.2 提取胎兒游離DNA：（1）離心 第一次離心：經(jīng)預(yù)處理后的血漿以1600×g的速度 離心10min，離心后取上清液置一20℃保存?zhèn)溆茫?第二次離心：將第一次離心后的上清液以13000—16000×g的速度高速離心10min，離心后取上清液置一20℃保存?zhèn)溆?。?）提取胎兒游離DNA： 取出上清液按

9、照血樣DNA提取試劑盒(QIAamp DNAbloodmini, Qia2gen)說(shuō)明書中血液DNA的提取方案提取DNA。,4.1.3 利用PCR技術(shù)進(jìn)行胎兒DNA擴(kuò)增: 采用15 bp的隨機(jī)引物，反應(yīng)體系為： l0×PCR緩沖液5μl ，Taq酶5 U，25 mmol／L MgC12 5 μl ，2.5 mmol／L dNTP 4μl ， 200 mmol／L 15 bp隨機(jī)引物5 μl ，加雙蒸水至50 μl ，置

10、于基因擴(kuò)增儀上。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min 后，開始循環(huán)：94℃ 1 min，37℃ 2 min，55℃ 4 min，循環(huán)30次，最后72℃ 延伸5 min，4℃保存。,4.1.4利用Southern分子印跡雜交法檢測(cè)出限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）進(jìn)行基因診斷 1．用BamHI內(nèi)切酶酶處理擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)體系如下： 待酶切DNA 1μg 雙蒸水

11、 適量 10X Buffer BamHI 2μl BamHI 0.5-1μl 總體積 20μl 37℃孵育1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間 結(jié)果可能獲得10kb、14kb兩種長(zhǎng)度的含a珠蛋白基因簇的DNA片段。,2．瓊脂糖凝膠電泳（1）加樣：取18μl胎兒DNA酶處理

12、液與2μl的DNA上樣緩沖液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。（2）電泳：加完樣后，插上導(dǎo)線，打開電源，按 照 需 要 調(diào) 節(jié) 電壓至120V，電泳開始，觀察電泳槽中負(fù)極的鉑金絲處是否有氣泡出現(xiàn)。（3）當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約1cm時(shí)，將電壓回零，關(guān)閉電源，停止電泳。（4）取出凝膠，在波長(zhǎng)為302nm的紫外燈下觀察染色后的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。,3．轉(zhuǎn)膜： 將凝膠中的單鏈DNA片段轉(zhuǎn)

13、移到硝酸纖維素濾膜 上。4．探針標(biāo)記： 將純化的DNA片段用放射性物質(zhì)（32p）標(biāo)記。5．預(yù)雜交（prehybridizafion）（1）把預(yù)雜交液放在滅菌的塑料瓶中，在水浴中預(yù)熱至雜交溫度（42℃）。 （2）將表面帶有目的DNA的硝酸纖維素濾膜放入一個(gè)稍寬于濾膜的塑料袋，用5-10ml2×SSC浸濕濾膜。,（3）將胎兒DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷 卻1-2min，使DNA變性。 （4）從塑

14、料袋中除凈2×SSC，加入預(yù)雜交液，按每平方濾膜加0.2ml。 （5）加入變性的胎兒DNA至終濃度200μg/ml。 （6）盡可能除凈袋中的空氣，用熱封口器封住袋口，上下顛倒數(shù)次以使其混勻，置于42℃水浴中溫育4h. 6．Southern雜交（1）將標(biāo)記的DNA探針置沸水浴10min，迅速置冰上冷卻1-2min，使DNA變性。 （2）從水浴中取出含有濾膜和預(yù)雜交液的塑料 袋，剪開一角，將變性的DNA探

15、針加到預(yù)雜交液中。,（3）盡可能除去袋中的空氣，封住袋口，滯留在袋中的氣泡要盡可能地少，為避免同位素污染水浴，將封好的雜交袋再封入另一個(gè)未污染的塑料袋內(nèi)。 （4）置42℃水浴溫育過(guò)夜（至少18h）。7．洗膜 取出NC膜，在2XSSC溶液中漂洗5min，然后按下列條件洗膜：2×SSC，42℃，10min；1×SCC，42℃，10min；0.5×SCC，42℃，10min；0.2×SSC，5

16、6℃，10min；0.1×SSC， 56℃，10min。邊洗邊用放射性檢測(cè)儀檢測(cè)放射強(qiáng)度，當(dāng)放射強(qiáng)度指示數(shù)值較環(huán)境背景高1-2倍時(shí)，即停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用濾紙吸干膜表面的水分，并用保鮮膜包裹。,8．放射性自顯影檢測(cè)（1）將濾膜正面向上，放入暗盒中（加雙側(cè)增感 屏）。 （2）在暗室內(nèi)，將2張X光底片放入曝光暗盒，并用透明膠帶固定，合上暗盒。將暗盒置-70℃低溫冰箱中使濾膜對(duì)X光底片

17、曝光（根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱決定曝光時(shí)間，一般在1-3天）。 （3）從冰箱中取出暗盒，置室溫1-2h，使其溫度上升至室溫，然后沖洗X光底片（洗片時(shí)先洗一張，若感光偏弱，則在多加兩天曝光時(shí)間，再洗第二張片子）。,4.2 注意事項(xiàng)： 1．胎兒游離DNA提取時(shí)應(yīng)盡量減少血樣放置時(shí)間，以減少細(xì)胞壞死和溶解，提高胎兒游離DNA的檢出率。2．PCR擴(kuò)增時(shí)，其最關(guān)鍵的是引物的設(shè)計(jì)：①長(zhǎng)度為15~30核苷酸，②GC含量50% ③TM值處于56℃—62℃之間

18、，④3`—末端必須嚴(yán)格與模板DNA配對(duì)，其構(gòu)成DNA延伸的起始點(diǎn)。3．PCR擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)的退火溫度應(yīng)慎重選擇，溫度高可提高特異性，但敏感性降低，溫度低則反之。4．印跡時(shí)，兩塊玻璃板之間灌的膠一定要早并且要防止膠漏。5．應(yīng)確保每孔上樣量一致，不致使帶跑得比窄。,6．倒膠的時(shí)候，用1ml的槍沿一側(cè)緩緩加，不要打到頭，以免帶入氣泡。7．轉(zhuǎn)膜過(guò)程中注意降溫，要防止微量進(jìn)樣器被 堵。8．內(nèi)切酶使用時(shí)宜存放在冰盒內(nèi)或冰浴上，使用完畢后宜立

19、即放置于-20℃保存。9．把Buffer和水等充分混勻后再加入內(nèi)切酶，加入內(nèi)切酶后可以用槍吹打或輕輕Vortex混勻。10．加樣時(shí)小心操作, 避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。,11．紫光燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩, 以免損傷眼睛。12．因?yàn)槟芙Y(jié)合DNA片段的膜同樣能夠結(jié)合探針DNA。因此，在進(jìn)行雜交前，必須將膜上所有能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)全部封閉，13．轉(zhuǎn)膜必需充分，要保證DNA已轉(zhuǎn)到膜上。14．若用到有毒物質(zhì)，

20、必需注意環(huán)保及安全。 15．在洗膜過(guò)程中，要不斷振蕩，不斷用放射性檢測(cè)儀探測(cè)膜上的放射強(qiáng)度。洗膜不充分會(huì)導(dǎo)致背景太深，洗膜過(guò)度又可能導(dǎo)致假陰性。16．保鮮膜與硝酸纖維素濾膜之間不能有氣泡。,5．實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果及遺傳指導(dǎo),預(yù)期結(jié)果： 1 2 3 4

21、 10kb 14kb,__________

22、 ______________ ___________ ___________,,（1）出現(xiàn)結(jié)果1（aa/aa），正常，建議生育；（2）出現(xiàn)結(jié)果2 (aa/a-)，靜止型a地中海貧血，患 者無(wú)任何臨床癥狀和異常血象， 僅在出生時(shí)的臍血中檢出1%—5%的Hb Bart’s。視情況建議生育；（3）出

23、現(xiàn)結(jié)果3（aa/--），輕型a地中海貧血，臨床上無(wú)明顯的臨床癥狀，個(gè)別人表現(xiàn)為輕度低色素小細(xì)胞性貧血，出生時(shí)有5%—15%的Hb Bart’s。紅細(xì)胞有輕度形態(tài)和滲透性改變，可查到少量的HbH包涵體。建議不生育；（5）出現(xiàn)結(jié)果4（a-/--），HbH病， 建議不生育；,6．參考文獻(xiàn)[1]王文博、張 毅、孫樹漢。孕婦外周血中胎兒游離DNA在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用，第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào) 2009年4月第30卷第4期。[2]王修海、姜曉靜、紀(jì)向虹

24、。孕婦血漿胎兒DNA檢測(cè)及其在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007年2月第43卷第1期。[3] 龍興江、龍桂芳、林偉雄。利用孕婦外周血漿中小片段游離胎兒DNA進(jìn)行a-地中海貧血無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2008年第16卷第10期。,[4] 羅娟、周國(guó)華。利用孕婦血漿中胎兒DNA進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的研究進(jìn)展，藥學(xué)與臨床研究雜志，2007年第15卷第4期。[5] 劉敬忠、王立榮、黃莉嘉、肖白、周艷。a地中海貧血的基因