沉默CD147基因?qū)θ巳橄侔㎝DA-MB-231細胞的影響.pdf

1、背景和目的：
　　乳腺癌是女性發(fā)病率最高的腫瘤，我國發(fā)病率為50.14/10萬，且呈不斷上升趨勢。乳腺上皮細胞在多種致癌因子作用下發(fā)生基因突變，癌細胞出現(xiàn)并惡性增殖使乳腺組織正常結(jié)構(gòu)被破壞，擠壓并侵蝕周圍正常組織，甚至威脅生命。然而及早發(fā)現(xiàn)診斷、早期治療的患者生存率顯著提高。目前，隨著分子生物和免疫學技術(shù)的不斷進步，對乳腺癌認識不斷深入，在其早期診斷和治療方面也取得了一定的進展。
　　CD147是一種細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導

2、因子(EMMPRIN)，在人體細胞內(nèi)分布廣泛，涉及到不同的病理生理過程，其中主要作用是參與細胞間及細胞與基質(zhì)間的黏附。腫瘤組織中CD147異常激活，一方面可通過成纖維細胞刺激合成基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)，另一方面可與整合素作用家族形成蛋白復合物刺激MMPs的生成，進而降解Ⅳ型膠原，破壞細胞外基質(zhì)，從而促進腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。因此我們推測抑制CD147的表達可能抑制乳腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。金屬

3、基質(zhì)蛋白酶組織特異性抑制劑(the tissue inhibitor ofmetalloproteinase，TIMPs)能特異性抑制內(nèi)源性的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，其既可以與MMP-2形成復合物而使后者失活，又可以阻止MMP-2與細胞表面接觸從而抑制其活性，對其具有雙重阻滯作用。正常情況下，MMP/TIMP處于動態(tài)平衡狀態(tài)。腫瘤癌變時MMP和TIMP表達都上調(diào)，但TIMP上調(diào)程度不足以抑制MMP能力時，破壞ECM的動態(tài)平衡，促使腫

4、瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。
　　CD147基因為目前研究的熱點，但是國內(nèi)外關(guān)于利用RNA干擾靶向CD147基因研究乳腺癌的報道較少。本研究構(gòu)建CD147慢病毒表達載體，轉(zhuǎn)染到乳腺癌MDA-MB-231細胞中，觀察其對乳腺癌MDA-MB-231細胞生長、增殖、遷移能力以及對MMP-2和TIMP-2 mRNA和蛋白表達的影響，然后建立裸鼠皮下乳腺癌移植瘤模型，觀察CD147siRNA對乳腺癌細胞成瘤的抑制作用。以此探討CD147作為乳腺癌的治療

5、提供新的有效的靶點的可行性。
　　方法：
　　1.免疫組化法檢測MDA-MB-231細胞中CD147、MMP-2、TIMP-2蛋白的表達。
　　2.病毒滴度測定，構(gòu)建CD147siRNA慢病毒載體并轉(zhuǎn)染各實驗組MDA-MB-231細胞（空白對照組、陰性對照組、CD147siRNA轉(zhuǎn)染組），采用RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測CD147siRNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞后不同時間點CD147mRNA和蛋

6、白改變，確定最佳時間點。
　　3.RT-PCR和Western Blot技術(shù)分別檢測CD147siRNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞后MMP-2、TIMP-2的mRNA和蛋白改變。
　　4.CCK-8法和劃痕實驗分別檢測轉(zhuǎn)染后各組MDA-MB-231細胞的增殖和遷移能力的改變。
　　5.細胞懸液法建立裸鼠皮下移植瘤模型，觀察CD147siRNA對裸鼠瘤體體重和體積的影響。
　　6.統(tǒng)計學分析:SPSS17.0軟件

7、處理，定量資料采用均數(shù)±標準差(Mean±SD)的形式表示，多組均數(shù)差異的比較采用單因素方差分析(ANOVA)，顯著水準α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1.免疫細胞化學實驗結(jié)果顯示，CD147蛋白、MMP-2蛋白、TIMP-2蛋白主要表達于MDA-MB-231細胞的胞膜/胞質(zhì)中，呈棕黃色染色或顆粒狀陽性表達。
　　2.成功構(gòu)建CD147siRNA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞后，CD147siRNA轉(zhuǎn)染組中C

8、D147mRNA和蛋白的表達量均下降，且具有時間依賴性，在72h時抑制率最高。
　　3.轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞72h后，CD147siRNA轉(zhuǎn)染組中MMP-2mRNA和蛋白的表達量也均下降;TIMP-2蛋白表達量下降，但其mRNA水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。
　　4.CCK-8試驗顯示慢病毒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞2d、3d、4d后，各組間細胞生長明顯受到抑制，與對照組細胞生長抑制率比較差異具有統(tǒng)計學意義。<