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文檔簡介
1、目的:
構(gòu)建鈣網(wǎng)織蛋白(calreticulin，CRT)基因的短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)質(zhì)粒載體，應(yīng)用本實驗室現(xiàn)存的CRT重組腺病毒載體，分別上調(diào)和下調(diào)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中鈣網(wǎng)織蛋白的表達(dá)。觀察對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響，誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)及侵襲能力的改變，并初步探討其可能機(jī)制。
方法:
設(shè)計并合成針對CRT基因的shRNA鏈，退火形成雙鏈，與酶切的
2、質(zhì)粒pGPU6/GFP連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5a菌株，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定和測序分析。實驗分為空白對照組、質(zhì)粒pGPU6/GFP空載體組、下調(diào)組和上調(diào)組。采用實時定量PCR法(Real time-PCR，RT-PCR)檢測各組細(xì)胞CRT基因的表達(dá)情況;Western blot法檢測各組細(xì)胞CRT蛋白的表達(dá)情況;MTT法檢測各處理因素對細(xì)胞增殖能力的影響;Annexin Ⅴ-PE/7-AAD雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況;Tr
3、answell法檢測各處理因素對細(xì)胞侵襲能力的影響。
結(jié)果:
本研究成功構(gòu)建了真核質(zhì)粒載體pGPU6-CRTshRNA，并成功導(dǎo)入到乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系中，RT-PCR檢測CRTmRNA表達(dá)和Westernblot檢測CRT蛋白表達(dá)均已得到證實。MTT法檢測細(xì)胞增殖能力，pGPU6-CRTshRNA明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，其余對照組無明顯作用。AnnexinⅤ-PE/7-AAD雙染流式細(xì)胞
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