儀器分析07-1-色譜法原理和基礎

1、Chromatography,中南民族大學,色譜法,內容,原理和基礎,氣相色譜,2,1,液相色譜,3,簡介,第一節(jié),一、色譜法的發(fā)展史,最早創(chuàng)立色譜法的是俄國植物學家Tswett1906年他為了分離植物色素，將植物綠葉的石油醚提取液倒入裝有碳酸鈣粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸鈣顆粒表面的吸附力不同，隨著淋洗的進行，不同色素向下移動的速度不同，形成一圈圈不同顏色的色帶，使各色素成分得到了分離。他將這種分離方

2、法命名為色譜法（chromatography）。,一、色譜法的發(fā)展史,在Tswett提出色譜概念后的20多年里沒有人關注這一偉大的發(fā)明。直到1931年德國的Kuhn和Lederer才重復了Tswett的某些實驗，用氧化鋁和碳酸鈣分離了α-，β-，和γ-胡蘿卜素，此后用這種方法分離了60多種這類色素。Martin和Synge在 1940年提出液液分配色譜法（Liquid－Liquid Partition Chromatography），

3、即固定相是吸附在硅膠上的水，流動相是某種有機溶劑。1941年Martin和Syngee提出用氣體代替液體作流動相的可能性，11年之后James和Martin發(fā)表了從理論到實踐比較完整的氣液色譜方法（Gas－Liquid Chromatography），因而獲得了1952年的諾貝爾化學獎。1957年Golay開創(chuàng)了開管柱氣相色譜法（Open－Tubular Column Chromatography）1956年Van Deemter等

4、在前人研究的基礎上發(fā)展了描述色譜過程的速率理論,一、色譜法的發(fā)展史,1944年Consden等就發(fā)展了紙色譜，1949年Macllean等在氧化鋁中加入淀粉粘合劑制作薄層板使薄層色譜法（TLC ）得以實際應用；60年代末把高壓泵和化學鍵合固定相用于液相色譜，出現了高效液相色譜（HPLC）；80年代初毛細管超臨界流體色譜（SFC）得到發(fā)展，但在90年代后未得到較廣泛的應用；在80年代初由Jorgenson等集前人經驗而發(fā)展起來的毛細

5、管電泳(CE)，在90年代得到廣泛的發(fā)展和應用。同時集HPLC和CZE優(yōu)點的毛細管電色譜在90年代后期受到重視。,色譜法起過關鍵作用的諾貝爾獎研究工作,色譜法在分析化學中的地位和作用,,不同年代各種分析方法所占的比例,二、色譜法的特點,色譜法是以其高超的分離能力為特點，它的分離效率遠遠高于其它分離技術如蒸餾、萃取、離心等方法。優(yōu)點分離效率高：可以分離復雜混合物，有機同系物、異構體、手性異構體。靈敏度高：可以檢測出μg.g-1(10

6、-6)級甚至ng.g-1(10-9)級的物質量。分析速度快：一般在幾分鐘或幾十分鐘內可以完成一個試樣的分析。應用范圍廣：氣相色譜：沸點低于400℃的各種有機或無機試樣的分析。液相色譜：高沸點、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。不足之處： 被分離組分的定性較為困難。,三、色譜法的分類,三、色譜法分類,按流動相和固定相的狀態(tài)分類,三、色譜法分類,按分離機理分類吸附色譜法：吸附能力強弱分配色譜法：溶解度不同離子交換色譜法：離子交換

7、劑（固定相）上的親和力大小不同尺寸排阻色譜法：多孔固定相中的選擇滲透親和色譜法：與固定相（固定化分子）的高專屬性親和力,三、色譜法分類,按固定相的外形分類柱色譜：固定相裝于柱內平板色譜：固定相呈平板狀薄層色譜紙色譜,色譜流出曲線及術語,第二節(jié),色譜的信號和曲線,色譜是一種分離技術色譜的信號都是外加的檢測儀器給出的信號是和組分的濃度成正比,色譜流出曲線及有關術語,,一．流出曲線和色譜峰,如果進樣量很小，濃度很低，在吸附

8、等溫線的線性范圍內，色譜峰如果對稱，可用Gauss正態(tài)分布函數表示：,式中：C—不同時間t時某物質的濃度，C0—進樣濃度，tr—保留時間，σ—標準偏差。,,二、基線 baseline,是柱中僅有流動相通過時，檢測器響應訊號的記錄值。穩(wěn)定的基線應該是一條水平直線.．,三、峰高 peak height,色譜峰頂點與基線之間的垂直距離，以h表示。,四、保留值 retention value,1．死時間 dead time, tM

9、 不被固定相吸附或溶解的物質進入色譜柱時，從進樣到出現峰極大值所需的時間稱為死時間。因為這種物質不被固定相吸附或溶解，故其流動速度將與流動相的流動速度相近。,,,,試樣從進樣開始到柱后出現峰極大點時所經歷的時間，稱為保留時間。它相應于樣品到達柱末端的檢測器所需的時間．,,2．保留時間 retention time, tR,3．調整保留時間tR′ 某組份的保留時間扣除死時間后稱為該組份的調整保留時間，即

10、 tR′ = tR-tM,由于組份在色譜柱中的保留時間tR包含了組份隨流動相通過柱子所需的時間和組份在固定相中滯留所需的時間，所以tR′實際上是組份在固定相中停留的總時間．保留時間可用時間單位（如s）或距離單位（如cm）表示。 保留時間是色譜法定性的基本依據，但同一組份的保留時間常受到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時用保留體積等參數進行定性檢定．,,4．死體積 VM 指色譜柱在填充

11、后，柱管內固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和．當后兩項很小而可忽略不計時，死體積可由死時間與流動相體積流速F0（L／min）計算：VM = tM·F0,5．保留體積 VR 指從進樣開始到被測組份在柱后出現濃度極大點時所通過的流動相體積。保留體積與保留時間t。的關系如下：,6．調整保留體積VR′ 某組份的保留體積扣除死體積后，稱該組份的調整保留體積

12、，即VR'= VR- VM,VR = tR·F0,,7．相對保留值γ21 或選擇因子,,由于相對保留值只與柱溫及固定相的性質有關，而與柱徑、柱長、填充情況及流動相流速無關，因此，它是色譜法中，特別是氣相色譜法中，廣泛使用的定性數據． 必須注意，相對保留值絕對不是兩個組份保留時間或保留體積之比 .,某組份2的調整保留值與組份1的調整保留值之比，稱為相對保留值：,色譜峰的區(qū)域寬度是組份在色譜柱中譜帶擴張的函數，它

13、反映了色譜操作條件的動力學因素．度量色譜峰區(qū)域寬度通常有三種方法：,1. 標準偏差σ 即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半 2. 半峰寬W1/2 即峰高一半處對應的峰寬，它與標準偏差σ的關系是： W1/2 = 2.354σ,五、區(qū)域寬度,,即色譜峰兩側拐點上的切線在基線上的截距，如圖中IJ的距離．它與標準偏差的關系是：,,,3.基線寬度W,從色譜流

14、出曲線上，得到信息是：,（l）根據色譜峰的個數，可以判斷樣品中所合組 份的最少個數． （2）根據色譜峰的保留值(或位置），可以進行定性分析． (3) 根據色譜峰下的面積或峰高，可以進行定量分析． （4）色譜峰的保留值及其區(qū)域寬度，是評價色譜柱分離效能的依據． （5）色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相(和流動相)選擇是否合適的依據．,,色譜法的基本原理,第三節(jié),基本原理,色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此

15、分離，組分要達到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠，兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數決定的，即與色譜過程的熱力學性質有關。但是兩峰間雖有一定距離，如果每個峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質和擴散行為決定的，即與色譜過程的動力學性質有關。,一、分配系數K和分配比k,1．分配系數K 如前所述，分配色譜的分離是基于樣品組分在固定相和流動相之間反復多次地分配過程，而吸附色譜

16、的分離是基于反復多次地吸附--脫附過程。這種分離過程經常用樣品分子在兩相間的分配來描述，而描述這種分配的參數稱為分配系數見它是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間分配達平衡時的濃度之比值，即,,2.分配比k,分配比又稱容量因子，它是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的質量比。即,,k值越大，說明組分在固定相中的量越多，相當于柱的容量大，因此又稱分配容量或容量因子。它是衡量色譜柱對被分離組分保

17、留能力的重要參數。k值也決定于組分及固定相熱力學性質。它不僅隨柱溫、柱壓變化而變化，而且還與流動相及固定相的體積有關。,式中CS，Cm分別為組分在固定相和流動相的濃度； Vm為柱中流動相的體積，近似等于死體積。Vs為柱中固定相的體積，在各種不同的類型的色譜中有不同的含義。例如：在分配色譜中，Vs表示固定液的體積；在尺寸排阻色譜中，則表示固定相的孔體積。,,3. 分配系數K與分配比k的關系,其中β稱為相比率，它是反映各種色譜柱型特點的又

18、一個參數。例如，對填充柱，其β值一般為6～35；對毛細管柱，其β值為60～600。,,,4．分配系數K及分配比k與選擇因子a的關系,根據對以上公式處理，對A、B兩組分的選擇因子，可用下式表示,,通過選擇因子a把實驗測量值k與熱力學性質的分配系數K直接聯系起來， a對固定相的選擇具有實際意義。如果兩組分的K或k值相等，則a =1，兩個組分的色譜峰必將重合，說明分不開。兩組分的K或k值相差越大，則分離得越好。因此兩組分具有不同的分配系數是色

19、譜分離的先決條件。,,最早由Martin等人提出塔板理論，把色譜柱比作一個精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為，同時引人理論塔板數作為衡量柱效率的指標。,二 塔板理論（plate theory）,L: 色譜柱長度H: 每一塊塔板的高度n: 理論塔板數,（i）在柱內一小段長度H內，組分可以在兩相間迅速達到平衡。這一小段柱長稱為理論塔板高度H。 （ii）以氣相色譜為例，載氣進入色譜柱不是連續(xù)進行的，而是

20、脈動式，每次進氣為一個塔板體積（ΔVm）。 （iii）所有組分開始時存在于第0號塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴散可忽略。 （iv）分配系數在所有塔板上是常數，與組分在某一塔板上的量無關。,塔板理論,根據上述假定，在色譜分離過程中，該組分的分布可計算如下： 開始時，若有單位質量，即m=1（例1mg或1μg）的該組分加到第0號塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。當一個板

21、體積（lΔV）的載氣以脈動形式進入0號板時，就將氣相中含有nm部分組分的載氣頂到1號板上，此時0號板液相（或固相）中ns部分組分及1號板氣相中的nm部分組分，將各自在兩相間重新分配。故0號板上所含組分總量為0.5，其中氣液（或氣固）兩相各為0.25而1號板上所含總量同樣為0.5．氣液（或氣固）相亦各為0.25。以后每當一個新的板體積載氣以脈動式進入色譜柱時，上述過程就重復一次(見下表)。,,,,按上述分配過程，隨著脈動進入柱中板體積載氣

22、的增加，組分分布在柱內任一板上的總量（氣液兩相中的總質量）,由塔板理論可建流出曲線方程：,m為組分質量，VR為保留體積，n為理論塔板數。 當流動相體積V=VR 時，C值最大，即,,,,,理論塔板數與色譜參數之間的關系為：tR應與W采取一樣的單位，如時間或距離。,,,從上兩式可以看出，色譜峰W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指標。 通常填充色譜柱的n＞103，H＜1mm。而毛細管柱 n

23、=105—106，H＜0.5mm 由于死時間tM包括在tR中,而實際的tM不參與柱內分配,所計算的n值盡大,H很小,但與實際柱效能相差甚遠。所以,提出把tM扣除,采用有效理論塔板數neff和有效塔板高Heff評價柱效能。,塔板理論僅僅是一種經驗理論，它能夠在熱力學的觀點上定量說明了流出曲線的形狀以及提出了評價色譜柱效的參數。但是，它缺乏動力學上方面的考慮。,,,塔板理論的特點和不足,(1)當色譜柱長度一定時，塔板數

24、n 越大(塔板高度 H 越小)，被測組分在柱內被分配的次數越多，柱效能則越高，所得色譜峰越窄。,(2)不同物質在同一色譜柱上的分配系數不同，用有效塔板數和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質。,(3)柱效不能表示被分離組分的實際分離效果，當兩組分的分配系數K相同時，無論該色譜柱的塔板數多大，都無法分離。,(4)塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的載氣流速下柱效不同的實驗結果，也無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。,三、速

25、率理論,van Deemter方程H：理論塔板高度， u：載氣的線速度(cm/s)A─渦流擴散項dp：固定相的平均顆粒直徑, λ:固定相的填充不均勻因子固定相顆粒越小dp↓，填充的越均勻，A↓，H↓，柱效n↑。表現在渦流擴散所引起的色譜峰變寬現象減輕，色譜峰較窄。,速率理論,B/u —分子擴散項濃度梯度造成g是彎曲因子，反映固定相顆粒的幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況，Dg為組分在流動相中的擴散系數對于液相色

26、譜，組分在流動相中縱向擴散可以忽略。Cu—傳質阻力項包括氣相傳質阻力項和液相傳質阻力項 C=Cg+Cl對于液相色譜，影響柱效的主要因素是傳質阻力項,速率理論的要點,(1) 組分分子在柱內運行的多路徑與渦流擴散、濃度梯度所造成的分子擴散及傳質阻力使氣液兩相間的分配平衡不能瞬間達到等因素是造成色譜峰擴展柱效下降的主要原因。(2) 通過選擇適當的固定相粒度、載氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。(3) 速率理論為色譜分離和操

27、作條件選擇提供了理論指導。闡明了流速和柱溫對柱效及分離的影響。(4) 各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴散項的影響減小，使柱效提高，但同時傳質阻力項的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質，但又加劇了分子擴散的影響，選擇最佳條件，才能使柱效達到最高。,分離度（resolution）,分離度又叫分辨率，用R表示。它定義為相鄰兩組分色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰底寬總和一半的比值。右圖中：a—選擇性和柱效都很差b—

28、選擇性好，但柱效差c—選擇性好，柱效也高,分離度的意義,R值越大，表明相鄰兩組分分離越好。一般說，當R＜1時，兩峰有部分重疊；當R＝1時，分離程度可達98％；當R＝1.5時，分離程度可達99．7％。通常用R=1.5作為相鄰兩組分已完全分離的標志。,基本色譜分離方程式,對于難分離的物質對，由于分配比k差別小，可以假設根據可得在實際應用時，用有效塔板數，,分離度和柱效的關系,對于一定理論塔板數的柱子，分離度的平方和

29、柱長成正比。即雖說用較長的柱可以提高分離度，但延長了分析時間。因此提高分離度的好方法是制備出一根性能優(yōu)良的柱子，通過降低板高，以提高分離度,分離度與選擇因子的關系,由基本色譜方程式判斷，當a =1時，R=0，這時，無論怎樣提高柱效也無法使兩組分分離。顯然， a大，選擇性好。研究證明， a的微小變化，就能引起分離度的顯著變化。一般通過改變固定相和流動相的性質和組成或降低柱溫，可有效增大a值。,分離度和容量因子,容量因子Q當

30、k>10時，R基本上變化不大。一般取k在2-10最宜。對于GC，提高溫度，改變k值，可以改進分離度。對于LC，改變流動相的組成，就能有效控制k值。,例題1,在一定條件下，兩個組分的調整保留時間分別為85秒和100秒，要達到完全分離，即R=1.5。計算需要多少塊有效塔板。若填充柱的塔板高度為0.1 cm，柱長是多少？a= 100 / 85 = 1.18n有效 = 16R2 [a / (a —1) ]2

31、 = 16×1.52 ×(1.18 / 0.18 ) 2= 1547（塊） L有效 = n有效·H有效 = 1547×0.1 = 155 cm 即柱長為1.55米時，兩組分可以得到完全分離。,例題2,根據van Deemter方程，推導出A、B、C常數表示的最佳線速uopt和最小塔板高Hmin。對上式微分可得：最佳線速處：

32、 所以最小塔板高為,例題3,理論塔板數增加一倍，分離度如何變化？若分離度要提高一倍，柱長要如何變化？分析時間將如何變化？所以理論塔板數增加一倍，分離度將變?yōu)?.4倍。分離度要提高一倍，柱長要增加3倍同樣分離時間也要提高3倍。,例題4,在一個3 m長的色譜柱上，分離一個樣品的結果如下：組分1的保留時間為14 min，組分2的保留時間為17 min(死時間和兩組份的峰底寬都為1.0 min)。求：(1) 兩組分

33、的調整保留時間t?r1和t?r2；(2) 用組分2求色譜柱的有效塔板數和有效塔板高度；(3) 兩組分的容量因子k1和k2；(4) 相對保留值?和分離度；(5) 若使兩組分的分離度為1.5，問所需要的最短柱長是多少？,t?r1=13.0min；t?r2=16.0min neff=16( )2=4096塊；Heff= =0.73mm (3) k1=13；k1=16(4) ?= =1.2；(5),,,對速率理論的修正

34、,1961年Giddings對Van Deemter方程做了修正,Huber于1967年又進一步把Giddings方程做了修改：,1976 年 Horvath 和 Lin 把 Huber 的速率理論方程修正為：,色譜法的定性定量分析,第四節(jié),一、色譜定性鑒定方法,1.利用純物質定性的方法 利用保留值定性：通過對比試樣中具有與純物質相同保留值的色譜峰，來確定試樣中是否含有該物質及在色譜圖中的位置。不適用于不同儀器上獲得的數據之間的對

35、比。 利用加入法定性：將純物質加入到試樣中，觀察各組分色譜峰的相對變化。,2.利用文獻保留值定性,利用相對保留值r21定性 相對保留值r21僅與柱溫和固定液性質有關。在色譜手冊中都列有各種物質在不同固定液上的保留數據，可以用來進行定性鑒定。,3.保留指數,又稱Kovats指數(Ⅰ)，是一種重現性較好的定性參數。測定方法： 將正構烷烴作為標準，規(guī)定其保留指數為分子中碳原子個數乘以100（如正己烷的保留指數為600）。

36、 其它物質的保留指數（IX）是通過選定兩個相鄰的正構烷烴，其分別具有Z和Z＋1個碳原子。被測物質X的調整保留時間應在相鄰兩個正構烷烴的調整保留值之間如圖所示：,保留指數計算方法,4.與其他分析儀器聯用的定性方法,小型化的臺式色質譜聯用儀（GC-MS；LC-MS） 色譜-紅外光譜儀聯用儀； 組分的結構鑒定,二、 色譜定量分析方法,1. 峰面積的測量 （1）峰高（h）乘半峰寬（Y 1/2）法：近似將色譜峰當作等腰三角

37、形。此法算出的面積是實際峰面積的0.94倍： A = 1.064 h·Y1/2 （2）峰高乘平均峰寬法：當峰形不對稱時，可在峰高0.15和0.85處分別測定峰寬，由下式計算峰面積： A = h·（Y 0.15 + Y 0.85 ）/ 2 （3）峰高乘保留時間法：在一定操作條件下，同系物的半峰寬與保留時間成正比，對于難于測量半

38、峰寬的窄峰、重疊峰（未完全重疊），可用此法測定峰面積： A = h·b·tR （4）自動積分和微機處理法,2. 定量校正因子,試樣中各組分質量與其色譜峰面積成正比，即： m i = fi ·Ai 絕對校正因子：比例系數f i ，單位面積對應的物質量：

39、f i =m i / Ai 定量校正因子與檢測器響應值成倒數關系： f i = 1 / Si 相對校正因子 ：即組分的絕對校正因子與標準物質的絕對校正因子之比。,當mi、mS以摩爾為單位時，所得相對校正因子稱為相對摩爾校正因子（f ’M）,用表示；當mi、mS用質量單位時, 以（f ’W）,表示。,3.常用的幾種定量方法,特點及要求： 歸一化法簡便、準確；進樣量的準確性和操作條件的

40、變動對測定結果影響不大；僅適用于試樣中所有組分全出峰的情況。,（1）歸一化法：,（2）外標法,外標法也稱為標準曲線法。,特點及要求： 外標法不使用校正因子，準確性較高， 操作條件變化對結果準確性影響較大。 對進樣量的準確性控制要求較高，適用于大批量試樣的快速分析。,（3）內標法,內標物要滿足以下要求：（a）試樣中不含有該物質；（b）與被測組分性質比較接近；（c）不與試樣發(fā)生化學反應；（d）出峰位

41、置應位于被測組分附近，且無組分峰影響。試樣配制：準確稱取一定量的試樣W，加入一定量內標物mS計算式：,內標法特點,(a) 內標法的準確性較高，操作條件和進樣量的稍許變動對定量結果的影響不大。(b) 每個試樣的分析，都要進行兩次稱量，不適合大批量試樣的快速分析。(c) 若將內標法中的試樣取樣量和內標物加入量固定，則：,例題5,以正十八烷為內標，分析燕敵麥1號中燕敵麥含量，稱取樣品8.12 g，加入內標物1.88g，測得燕敵麥含量和