儀器分析-高效液相色譜法

1、1,第三章 高效液相色譜法(HPLC),High Performance Liquid Chromatography,2,3,4,5,高效液相色譜法是繼氣相色譜之后，70年代初期發(fā)展起來(lái)的一種以液體做流動(dòng)相的新色譜技術(shù).,§3- 1 高效液相色譜法概述,6,,,7,高效液相色譜,8,三 、液相色譜分離原理及分類,液相色譜分離的實(shí)質(zhì)是樣品分子（以下稱溶質(zhì)）與溶劑（即流動(dòng)相或洗脫液）以及固定相分子間的作用，作用力的大小，決定色

2、譜過(guò)程的保留行為。,根據(jù)分離機(jī)制不同，液相色譜可分為：液固吸附色譜、液液分配色譜、化學(xué)鍵合相色譜、離子交換色譜以及分子排阻色譜等類型。,9,四、液相色譜與氣相色譜的比較,,10,,2、不同點(diǎn),11,氣相色譜僅能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質(zhì)。對(duì)高沸點(diǎn)化合物、非揮發(fā)性物質(zhì)、熱不穩(wěn)定化合物、離子型化合物及高聚物的分離、分析較為困難。使其應(yīng)用受到一定程度的限制，據(jù)統(tǒng)計(jì)只有大約20%的有機(jī)物能用氣相色譜分析；,而液相色譜則不受樣品揮發(fā)度和

3、熱穩(wěn)定性的限制，它非常適合分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)、離子型化合物及高聚物的分離分析，大約占有機(jī)物的70 ~ 80%。,12,,（3）液相色譜分離能力比氣相色譜更強(qiáng),因?yàn)椋孩贇庀嗌V的流動(dòng)相載氣是色譜惰性的，不參與分配平衡過(guò)程，與樣品分子無(wú)親和作用，樣品分子只與固定相相互作用（只能選擇固定相）。,而在液相色譜中，流動(dòng)相液體也與固定相爭(zhēng)奪樣品組分分子，為提高選擇性增加了一個(gè)因素。還可選用不同比例的兩種或兩種以上的液體作流

4、動(dòng)相，增大分離的選擇性（能同時(shí)選擇固定相和流動(dòng)相） 。,13,②液相色譜固定相類型多,如離子交換色譜和排阻色 譜等，作為分析時(shí)選擇余地大；而氣相色譜是不 可能的。 ③ 液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般 有利于色譜分離條件的選擇。,（4）液相色譜中制備樣品簡(jiǎn)單，回收樣品也比較容 易，而且回收是定量的，可以做成制備色譜。,（5）液相色譜尚缺乏通用的檢測(cè)器，儀器比較復(fù) 雜，價(jià)格昂貴。在實(shí)際應(yīng)

5、用中，這兩種色譜 技術(shù)是互相補(bǔ)充的。,14,綜上所述，高效液相色譜法具有高柱效、高選擇性、分析速度快、靈敏度高、重復(fù)性好、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。該法已成為現(xiàn)代分析技術(shù)的重要手段之一，目前在化學(xué)、化工、醫(yī)藥、生化、環(huán)保、農(nóng)業(yè)等科學(xué)領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用。,15,§3- 2影響色譜峰擴(kuò)展及色譜分離的因素（液相色譜速率理論）,與氣相色譜速率理論對(duì)照自學(xué)。,16,1.,§3- 3、4、5 高

6、效液相色譜的主要類型及分離原理,1、吸附色譜（液-固吸附色譜）：以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動(dòng)相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。,2、分配色譜（液-液分配色譜）：早期通過(guò)在載體上涂漬一薄層固定液制備固定相, 現(xiàn)多為化學(xué)鍵合固定相，即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過(guò)化學(xué)鍵將固定液結(jié)合在載體表面。,17,3.離子交換色譜：固定相為離子交換樹(shù)脂，流動(dòng)相為無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿的水溶液。各種離子根據(jù)它們與樹(shù)脂

7、上的交換基團(tuán)的交換能力的不同而得到分離。,4.離子對(duì)色譜法：將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對(duì)，從而控制溶質(zhì)離子保留行為的一種色譜法。,18,5.離子色譜法：用離子交換樹(shù)脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動(dòng)相，以電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)組分含量，用抑制柱消除強(qiáng)電解質(zhì)背景離子對(duì)電導(dǎo)檢測(cè)器的干擾。（與離子交換色譜法不同的是分離組分的檢測(cè)器不同）,6.凝膠色譜（空間排阻色譜）：以凝膠為

8、固定相。凝膠是一種經(jīng)過(guò)交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠。,19,二、液一液分配色譜法（LLPC）,在液-液色譜中，流動(dòng)相和固定相都是液體，它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無(wú)論是極性的和非極性的、水溶性和油溶性的、離子型的和非離子型的化合物。,1．分離原理 液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，

9、具有不同的分配系數(shù)。所不同的是液液色譜的分配是在柱中進(jìn)行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進(jìn)行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分。,20,(1)擔(dān)體(表面多孔型) 它是30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1 ～ 2μm的多孔硅膠。由于固定相僅是表面很薄一層，因此，傳質(zhì)速度快，加之是直徑很小的均勻球體，裝填容易，重現(xiàn)性好，現(xiàn)已廣泛使用！ 但表面積小，柱容量低，需用高靈敏度檢測(cè)器。,2、固定相

10、,21,,由于液液色譜中流動(dòng)相參與選擇競(jìng)爭(zhēng)，因此，對(duì)固定液選擇較簡(jiǎn)單，只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問(wèn)題。,（2）固定液,A 強(qiáng)極性固定液β，β′一氧二丙腈 B 中等極性的聚乙二醇 C 非極性的角鯊?fù)榈取?22,為了更好解決固定液在載體上流失問(wèn)題。產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定相。 它是將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面的一種方法，它代替了固定液的機(jī)械涂漬，因此它的產(chǎn)生對(duì)液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作

11、用，可以認(rèn)為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個(gè)革命性突破。 是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有3/4以上的分離問(wèn)題是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行的。,（4）化學(xué)鍵合固定相（CBPC）,23,,A 原理：利用化學(xué)反應(yīng)，使硅膠表面的硅羥基與 各種固定液有機(jī)物或有機(jī)硅化合物反有 應(yīng)，將固定相與載體之間形成化學(xué)鍵， 采用化學(xué)鍵合相的液相色譜稱化學(xué)鍵合 相色 譜法。,

12、由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于梯度淋洗，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。由于鍵合到載體表面的官能團(tuán)可以是各種極性的，因此它適用于種類繁多樣品的分離。,24,B 化學(xué)鍵合類型,25,26,此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠—C18H37（ODS，C18）、硅膠—苯基等；流動(dòng)相是采用極性較強(qiáng)的溶劑，如甲醇—水、乙腈一水、水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖溶液等，由于流動(dòng)相極性大于固定相極性，稱反相健合相色譜法。,27,,

13、A 它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物；B 采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液為流動(dòng)相，也可用于分離極性化合物；C 若采用水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖液為流動(dòng)相，則可分離一些易離解的樣品，如有機(jī)酸、有機(jī)堿、酚類等。 反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無(wú)拖尾色譜峰的優(yōu)點(diǎn)。,28,,這種色譜方法主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。,（3）離子型鍵合相色譜法,以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵合各

14、種離子交換基團(tuán)，如—SO3H、—CH2NH2、—COOH等時(shí)，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相；流動(dòng)相一般采用緩沖溶液。其分離原理與離子交換色譜類同。,29,,3、流動(dòng)相,在液液色譜中為了避免固定液的流失。對(duì)流動(dòng)相的一個(gè)基本要求是流動(dòng)相盡可能不與固定相互溶，而且流動(dòng)相與固定相的極性差別越顯著越好。根據(jù)所使用的流動(dòng)相和固定相的極性程度。,正相分配色譜: 適用于極性化合物的分離，其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。反相分配色譜

15、： 適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰好相反。,30,三、液一固吸附色譜法(LSAC),液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實(shí)質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來(lái)進(jìn)行分離的。,1、分離原理 當(dāng)流動(dòng)相通過(guò)固定相（吸附劑）時(shí)，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動(dòng)相分子。同時(shí)，當(dāng)試樣分子（X）被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，與流動(dòng)相溶劑分子（S）在固定相表面

16、發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附: X + n S吸附= X吸附 + nS,31,,其中K為吸附平衡常數(shù)，K值大表示組分在吸附劑上保留強(qiáng)，難于洗脫。K值小,則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。K值可通過(guò)吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。,達(dá)平衡時(shí)，有：,32,,2、固定相,吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強(qiáng)弱不同的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等。等。由于硅膠的優(yōu)點(diǎn)較多，因此，以硅膠用得最多。,33,,

17、一般把液-固吸附色譜中流動(dòng)相稱作洗脫劑。在吸附色譜中對(duì)極性大的試樣往往采用極性強(qiáng)的洗脫劑；對(duì)極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。,3、流動(dòng)相,34,,四、離子交換色譜法（IEC）,利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來(lái)測(cè)定溶液中陽(yáng)離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無(wú)機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。,1、離子

18、交換原理,離子交換色譜法是利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相離子交換劑交換能力的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。,35,固定相采用離子交換樹(shù)脂，樹(shù)脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹(shù)脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換。,2、離子交換固定相,36,,陽(yáng)離子交換：,陰離子交換：,一般形式：,離子交換反應(yīng)：,37,,固定相基質(zhì)大致有三大類：合成樹(shù)脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。 離子交換劑又有陽(yáng)離子和陰離子之分。再根據(jù)官

19、能基的離解度大小還有強(qiáng)弱之分（見(jiàn)下表）,,38,,3、離子交換色譜流動(dòng)相,離子交換色譜法所用流動(dòng)相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強(qiáng)度）水的緩沖溶液。 通過(guò)改變流動(dòng)相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。,分離有機(jī)酸和有機(jī)堿時(shí)，這些酸堿的離解程度可通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值來(lái)控制。增大pH值會(huì)使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低pH值，其結(jié)果相反。但無(wú)論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會(huì)使樣品的保留增大。,3

20、9,五、離子色譜法（IC）,離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來(lái)的一種分離方法。1、離子交換色譜法對(duì)無(wú)機(jī)離子分離檢測(cè)的困難 在普通離子交換法中，對(duì)于那些不能采用紫外檢測(cè)器的被測(cè)離子，如采用電導(dǎo)檢測(cè)器，由于被測(cè)離子的電導(dǎo)信號(hào)被強(qiáng)電解質(zhì)流動(dòng)相的高背景電導(dǎo)信號(hào)掩沒(méi)而無(wú)法檢測(cè)，因而，離子交換色譜法在無(wú)機(jī)離子的分析和應(yīng)用受到限制。,40,為了解決這一問(wèn)題，1975年Small等人提出一種能同時(shí)測(cè)定多種無(wú)機(jī)和有機(jī)離子的新技術(shù)。他們?cè)陔x子交

21、換分離柱后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹(shù)脂。通過(guò)分離柱后的樣品再經(jīng)過(guò)抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)的流動(dòng)相。,2、離子色譜法原理 以離子交換樹(shù)脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動(dòng)相，利用抑制柱消除流動(dòng)相強(qiáng)電解質(zhì)對(duì)測(cè)量影響，以電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)組分信號(hào)的色譜分析方法。,41,例如對(duì)于陰離子分析，色譜柱內(nèi)為陰離子交換樹(shù)脂，在流動(dòng)相中，待測(cè)陰離子（如Br-）與陰離子交換樹(shù)脂上的OH-離子交換：,交換,42

22、,在陰離子分析中，最常見(jiàn)的洗脫液是NaOH ，洗脫過(guò)程中，OH-離子從分離柱的陰離子交換位置置換出待測(cè)陰離子Br-。當(dāng)待測(cè)陰離子從柱中被洗脫下來(lái)進(jìn)入檢測(cè)器電導(dǎo)池時(shí)，要求能檢測(cè)出洗脫液中電導(dǎo)的改變。但洗脫液中OH-離子的濃度要比試樣中陰離子濃度大得多才能使色譜柱正常工作。因此，與洗脫液的電導(dǎo)值相比，由于試樣離子進(jìn)入洗脫液而引起的電導(dǎo)的改變非常小，因而，用電導(dǎo)檢測(cè)器直接檢測(cè)試樣中離子的靈敏度極差。,43,若在色譜柱中，設(shè)立一個(gè)抑制柱，抑制柱

23、中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹(shù)脂。通過(guò)分離柱后的樣品再經(jīng)過(guò)抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)的流動(dòng)相。 上例分析中，若使分離后的洗脫液通過(guò)填充有高容量H+型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的抑制柱，則在抑制柱將發(fā)生如下反應(yīng)：,44,可見(jiàn)，從抑制柱中流出的洗脫液中，洗脫液（NaOH）已經(jīng)變成電導(dǎo)很小的水，消除了本底的影響；試樣陰離子則轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的酸，由于H+的離子趟度很大，所以，大大提高了電導(dǎo)檢測(cè)的靈敏度。,3、離子色譜法裝置

24、,45,46,4、離子色譜法優(yōu)點(diǎn),雙柱；薄殼型陰離子交換樹(shù)脂分離柱(3×250 mm),流動(dòng)相：0.003mol·L-1 NaHCO3 / 0.0024 mol·L-1 Na2CO3，流量138 mL/h。 七種陰離子在20 min內(nèi)基本上得到完全分離，各組分含量在3～50 ppm。,47,,48,離子對(duì)分配機(jī)理： 離子對(duì)色譜的分離機(jī)理主要是離子對(duì)分配機(jī)理;假如有一離子對(duì)色譜體系，固定

25、相為非極性鍵合相，流動(dòng)相為水溶液;在流動(dòng)相中加入一種電荷與待分離組分離子X(jué)+帶相反的對(duì)離子Y-，則組分離子X(jué)+與對(duì)離子Y-首先形成離子對(duì)化合物X+ Y-，然后在固定相和流動(dòng)相中分配：,49,由于離子對(duì)化合物X+ Y-具有疏水性，因而被非極性固定相提取。組分離子的性質(zhì)不同，它與反離子形成離子對(duì)的能力大小不同以及形成的離子對(duì)疏水性質(zhì)不同，導(dǎo)致各組分離子在固定相中滯留時(shí)間不同，因而出峰先后不同。這就是離子對(duì)色譜法分離的基本原理。,50,平衡

26、常數(shù)：,51,正相離子對(duì)色譜法：極性疏水性固定相，非極性流動(dòng)相；,反相離子對(duì)色譜法：這種色譜法的固定相采用非極性的疏水性化學(xué)鍵合固定相［如十八烷基鍵合相（ODS）等］，流動(dòng)相為加有平衡離子（反離子）的極性溶液（如甲醇一水或乙睛一水）。,鍵合相反相離子對(duì)色譜法操作簡(jiǎn)便，只要改變流動(dòng)相的pH值、平衡離子的濃度和種類，就可在較大范圍內(nèi)改變分離的選擇性，能較好解決難分離混合物的分離問(wèn)題。此法發(fā)展迅速，應(yīng)用較廣泛。,52,,七、凝膠色譜法（SEC

27、）,1、定義： 基于試樣中組分分子的尺寸和形狀不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的色譜分析方法，稱凝膠色譜法，又名尺寸排阻色譜法，主要用于較大分子的分離。,53,凝膠: 指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過(guò)交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類：,（1）軟性凝膠 具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動(dòng)相，一般用于小分子質(zhì)量物

28、質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。 如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠,54,（2）半剛性凝膠 比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。用于高效液相色譜時(shí)，流速不宜大。 如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）,（3）剛性凝膠 溶脹性最差。它們既可用水溶性溶劑，又可用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，可在較高壓強(qiáng)和較高流速下操作。一般控制壓強(qiáng)小于7MPa，流速＜1cm3

29、83;s-1；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分離。 如多孔硅膠、多孔玻璃等。,55,A 凝膠色譜譜所選用的流動(dòng)相必須能溶解樣品，同時(shí)必須能溶脹凝膠。B 流動(dòng)相的粘度要小。C 所選擇的流動(dòng)相還必須與檢測(cè)器相匹配。D 以水溶液為流動(dòng)相的凝膠色譜適用于水溶性樣品，以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。,3、凝膠色譜流動(dòng)相,常用的流動(dòng)相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。,56,(1)保留時(shí)間是分子尺寸的函數(shù)

30、，有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息；(2) 保留時(shí)間短，譜峰窄，易檢測(cè)，可采用靈敏度較 低的檢測(cè)器；(3) 固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子 基本不保留分子，因此柱壽命長(zhǎng)；(4) 不能分辨分子大小相近的化合物，相對(duì)分子質(zhì)量 差別必須大于10％才能得以分離。,4、凝膠色譜的特點(diǎn),凝膠色譜被廣泛應(yīng)用于大分子的分級(jí)，即用來(lái)分析大分子物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的分布。它具有其他液相色譜所沒(méi)有的特點(diǎn)：,57,,八、高效液相

31、色譜流動(dòng)相,一、流動(dòng)相分類 1、按組成不同可分為單組分和多組分； 2、按極性可分為極性、弱極性、非極性；,二、常用溶劑: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。,58,由于高效液相色譜中流動(dòng)相是液體，它對(duì)組分有親和力，并參與固定相對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)。因此，正確選擇流動(dòng)相直接影響組分的分離度。,（1）溶劑對(duì)于待

32、測(cè)樣品，必須具有合適的極性和良 好的選擇性。（2）溶劑要與檢測(cè)器匹配。對(duì)于紫外吸收檢測(cè)器，應(yīng)注意選用檢測(cè)器波長(zhǎng)比溶劑的紫外截止波長(zhǎng)要長(zhǎng)。所謂溶劑的紫外截止波長(zhǎng)指當(dāng)小于截止波長(zhǎng)的輻射通過(guò)溶劑時(shí)，溶劑對(duì)此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，此時(shí)溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測(cè)量。下表列出了一些常用溶劑的紫外截止波長(zhǎng)。,三、對(duì)流動(dòng)相溶劑的要求：,59,（3）純度要高。由于高效液相色譜靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引

33、起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。,60,（4）化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑。（5）粘度要低。若使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘度過(guò)于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分離。,61,§3–6 高效液相色譜儀,五大部分：高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理與輸出系統(tǒng)。,一、儀器基本組成,62,工作過(guò)程如下：

34、首先高壓泵將貯液器中流動(dòng)相經(jīng)過(guò)進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入待分離的樣品時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動(dòng)相將樣品同時(shí)帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測(cè)器，記錄儀將檢測(cè)器送出的信號(hào)記錄下來(lái)，由此得到液相色譜圖。,63,二、各部分功能簡(jiǎn)介,1、高壓輸液系統(tǒng) 包括溶劑貯存器、高壓輸液泵、梯度洗脫裝置和壓力表等組成。,（1）溶劑貯存器：由玻璃、不銹鋼、聚四氟乙烯 塑料等制成容量1～2 L容器，用于貯存足夠

35、 數(shù)量、符合要求的流動(dòng)相。,64,,B 對(duì)高壓輸液泵的要求：,（2）高壓輸液泵,A 作用：將溶劑貯存器中的流動(dòng)相以高壓形式連續(xù) 不斷地送入流路系統(tǒng)，它是HPLC的關(guān)鍵 部件，要求壓力：150～450×105 Pa。 。,65,恒流泵：在一定操作條件下，輸出流動(dòng)相流量保 持恒定，而與色譜柱引起阻力變化無(wú)關(guān)；,恒壓泵：能保持輸出壓力恒定，但其流

36、量則隨色 譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時(shí)間的重現(xiàn) 性差。,它們各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前恒流泵比恒壓泵優(yōu)越，使用較普遍,恒流泵分機(jī)械注射泵和機(jī)械往復(fù)泵兩種。,C 高壓輸液泵類別,66,67,,2、進(jìn)樣系統(tǒng),高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30 cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。 柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)器中存在死體積。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主

37、要因素，因此高效液相色譜法中對(duì)進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。,68,,（4）六通閥進(jìn)樣裝置工作示意圖,69,70,3、分離系統(tǒng)——色譜柱,71,,72,A 溶劑要脫氣，溶劑和樣品應(yīng)過(guò)濾， 防止堵塞。B 更換流動(dòng)相要漸變。C 用后要清洗。D 不用時(shí)要保存好。,（4）使用色譜柱注意事項(xiàng)：,73,,4、檢測(cè)系統(tǒng),（1）作用：將色譜柱流出組分進(jìn)行檢測(cè)，并將濃 度或質(zhì)量信號(hào)轉(zhuǎn)變成電信號(hào)輸出。,（2）要求：A 靈敏度高；

38、 B 穩(wěn)定性好； C 線性范圍寬； D 死體積?。?E 對(duì)流動(dòng)相流量變化不敏感。,74,是HPLC中應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器。它的原理基于待測(cè)組分對(duì)特定波長(zhǎng)的紫外或可見(jiàn)光的選擇性吸收，試樣濃度與吸光度的關(guān)系服從朗伯-比爾定律。,A 紫外光度檢測(cè)器（UV）,優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，選擇性好，對(duì)流

39、量和溫度的變化不敏感，適用于梯度淋洗，線性范圍寬，適用于痕量分析。最小檢測(cè)量10-9g·mL-1。,（3）常用的高效液相色譜檢測(cè)器,75,缺點(diǎn)：只適用于檢測(cè)能吸收紫外、可見(jiàn)光的物質(zhì)，流動(dòng)相選擇受限制。要求流動(dòng)相在測(cè)定波長(zhǎng)下無(wú)吸收。,76,77,78,79,,C 示差折光率檢測(cè)器,檢測(cè)器是一種通用型檢測(cè)器。它的作用原理是純流動(dòng)相與包含樣品的流動(dòng)相之間的折射率不同，檢測(cè)器把這種差值檢測(cè)出來(lái)，給出信號(hào)，信號(hào)的大小與樣品含量成正比。

40、純流動(dòng)相與待測(cè)組分的折射率相差越大，檢測(cè)器靈敏度越高，靈敏度可達(dá)10-7g·cm-3。 通用性強(qiáng)，不破壞樣品，線性范圍寬。主要缺點(diǎn)是靈敏度低，不適宜痕量分析，對(duì)溫度變化敏感，并且不能用于梯度淋洗。,80,D 熒光檢測(cè)器E 電導(dǎo)檢測(cè)器 F 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器,81,它包括脫氣、梯度淋洗、溫控、自動(dòng)進(jìn)樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置。其中梯度淋洗裝置是高壓液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置 。,5、高效液相色譜附屬系統(tǒng),（1）什么

41、是梯度洗脫？,在流動(dòng)相中，使用兩種或兩種以上不同性質(zhì)的溶劑，使其按一定程序改變配比，從而使流動(dòng)相極性、pH、離子強(qiáng)度相應(yīng)變化，達(dá)到改變待分離樣品的選擇因子和保留時(shí)間，提高分離效果和分析速度的目的。,HPLC梯度淋洗與GC中的程序升溫類似。,82,（2）梯度洗脫分類,外梯度洗脫（低壓梯度）: 通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥，將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例先混合后，再用高壓輸液泵壓入色譜柱系統(tǒng)（只需一臺(tái)泵）。,內(nèi)梯度洗脫（高壓

42、梯度）: 兩種或多種流動(dòng)相分別用泵加壓后，按一定比例混合，再輸入色譜柱系統(tǒng)（需二臺(tái)甚至多臺(tái)泵）。,83,84,§3–7 色譜分離方法類型的選擇,一、色譜分析方法選擇的依據(jù),1、分析樣品的性質(zhì)：相對(duì)分子量；化學(xué)結(jié)構(gòu)；極 性；溶解度等。,2、液相色譜分離類型的特點(diǎn)：液-固；液-液；離子 交換；離子對(duì)色譜；離子色譜等。,3、實(shí)驗(yàn)室具體條件。,8

43、5,二、相對(duì)分子質(zhì)量與色譜分析方法選擇,一般而言：氣相色譜：相對(duì)分子質(zhì)量 2000。,三、液相色譜分析類別選擇,86,87,§3–8 高效液相色譜法應(yīng)用示例,88,89,2. 稠環(huán)芳烴的分析,稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。,固定相：十八烷基硅烷化鍵合相 流動(dòng)相：20%甲醇-水 ～100%甲醇線性梯度淋洗， 2%/min 流 速：1mL/min 柱 溫：50 ºC 柱

44、 壓：70 ?104 Pa 檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器,90,91,§3–9 液相制備色譜（Preparative Liquid Chromatography）,一、什么是制備色譜？ 采用色譜分離技術(shù)分離、獲得高純物質(zhì)（色譜純）的方法。二、液相色譜是理想的制備色譜1、液相色譜分離條件溫和；2、分離檢測(cè)過(guò)程不破壞樣品；3、分離后產(chǎn)品易于回收。,92,三、色譜柱的柱容量（柱負(fù)荷） 對(duì)分析柱：

45、不影響柱效時(shí)的最大進(jìn)樣量； 對(duì)制備柱：不影響收集物純度時(shí)的最大進(jìn)樣量； 超載：進(jìn)樣量超過(guò)柱容量，柱效迅速下降，峰變寬。 超載可提高制備效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%為宜。,四、液相制備色譜的方法 例如：分離樣品中的微量或痕量組分時(shí)：,93,產(chǎn)物為兩主成分之間的小組分 改變色譜條件，使色譜柱超載分離切分，使待分離組分成為主成分（富集）后，再次分離制備,94,五、制備型液相色

46、譜,結(jié)構(gòu)與分析型一樣，但泵流量大、進(jìn)樣量大、采用制備柱；柱后餾分收集器。 制備柱：內(nèi)徑20～50 mm，柱長(zhǎng)50 cm。,95,§3–10 毛細(xì)管電泳（Capillary Electrophoresis，CE）,一、概述,在電解質(zhì)溶液中，位于電場(chǎng)中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實(shí)現(xiàn)分離。,96,1937年

47、，Tiselius(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進(jìn)行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白； 并發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定； 第一次的自由溶液電泳；第一臺(tái)電泳儀； 1948年，獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)；,97,二、經(jīng)典電泳分析,利用電泳現(xiàn)象對(duì)某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。 按形狀分類：U型管電泳、

48、柱狀電泳、板電泳； 按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳；,傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無(wú)法與其他分析相比。,1981年，Jorgenson和Luckas，用75 µm內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析，柱效高達(dá)40萬(wàn)/m，促進(jìn)電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)——高效毛細(xì)管電泳。,98,三、高效毛細(xì)管電泳,高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要