儀器分析-高效液相色譜法

1、1,第三章 高效液相色譜法(HPLC),High Performance Liquid Chromatography,2,3,4,5,高效液相色譜法是繼氣相色譜之后，70年代初期發(fā)展起來的一種以液體做流動相的新色譜技術.,§3- 1 高效液相色譜法概述,6,,,7,高效液相色譜,8,三 、液相色譜分離原理及分類,液相色譜分離的實質(zhì)是樣品分子（以下稱溶質(zhì)）與溶劑（即流動相或洗脫液）以及固定相分子間的作用，作用力的大小，決定色

2、譜過程的保留行為。,根據(jù)分離機制不同，液相色譜可分為：液固吸附色譜、液液分配色譜、化學鍵合相色譜、離子交換色譜以及分子排阻色譜等類型。,9,四、液相色譜與氣相色譜的比較,,10,,2、不同點,11,氣相色譜僅能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質(zhì)。對高沸點化合物、非揮發(fā)性物質(zhì)、熱不穩(wěn)定化合物、離子型化合物及高聚物的分離、分析較為困難。使其應用受到一定程度的限制，據(jù)統(tǒng)計只有大約20%的有機物能用氣相色譜分析；,而液相色譜則不受樣品揮發(fā)度和

3、熱穩(wěn)定性的限制，它非常適合分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)、離子型化合物及高聚物的分離分析，大約占有機物的70 ~ 80%。,12,,（3）液相色譜分離能力比氣相色譜更強,因為：①氣相色譜的流動相載氣是色譜惰性的，不參與分配平衡過程，與樣品分子無親和作用，樣品分子只與固定相相互作用（只能選擇固定相）。,而在液相色譜中，流動相液體也與固定相爭奪樣品組分分子，為提高選擇性增加了一個因素。還可選用不同比例的兩種或兩種以上的液體作流

4、動相，增大分離的選擇性（能同時選擇固定相和流動相） 。,13,②液相色譜固定相類型多,如離子交換色譜和排阻色 譜等，作為分析時選擇余地大；而氣相色譜是不 可能的。 ③ 液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般 有利于色譜分離條件的選擇。,（4）液相色譜中制備樣品簡單，回收樣品也比較容 易，而且回收是定量的，可以做成制備色譜。,（5）液相色譜尚缺乏通用的檢測器，儀器比較復 雜，價格昂貴。在實際應

5、用中，這兩種色譜 技術是互相補充的。,14,綜上所述，高效液相色譜法具有高柱效、高選擇性、分析速度快、靈敏度高、重復性好、應用范圍廣等優(yōu)點。該法已成為現(xiàn)代分析技術的重要手段之一，目前在化學、化工、醫(yī)藥、生化、環(huán)保、農(nóng)業(yè)等科學領域獲得廣泛的應用。,15,§3- 2影響色譜峰擴展及色譜分離的因素（液相色譜速率理論）,與氣相色譜速率理論對照自學。,16,1.,§3- 3、4、5 高

6、效液相色譜的主要類型及分離原理,1、吸附色譜（液-固吸附色譜）：以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。,2、分配色譜（液-液分配色譜）：早期通過在載體上涂漬一薄層固定液制備固定相, 現(xiàn)多為化學鍵合固定相，即用化學反應的方法通過化學鍵將固定液結(jié)合在載體表面。,17,3.離子交換色譜：固定相為離子交換樹脂，流動相為無機酸或無機堿的水溶液。各種離子根據(jù)它們與樹脂

7、上的交換基團的交換能力的不同而得到分離。,4.離子對色譜法：將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱對離子或反離子）加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對，從而控制溶質(zhì)離子保留行為的一種色譜法。,18,5.離子色譜法：用離子交換樹脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動相，以電導檢測器檢測組分含量，用抑制柱消除強電解質(zhì)背景離子對電導檢測器的干擾。（與離子交換色譜法不同的是分離組分的檢測器不同）,6.凝膠色譜（空間排阻色譜）：以凝膠為

8、固定相。凝膠是一種經(jīng)過交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠。,19,二、液一液分配色譜法（LLPC）,在液-液色譜中，流動相和固定相都是液體，它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的、水溶性和油溶性的、離子型的和非離子型的化合物。,1．分離原理 液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，

9、具有不同的分配系數(shù)。所不同的是液液色譜的分配是在柱中進行的，使這種分配平衡可反復多次進行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復雜組分。,20,(1)擔體(表面多孔型) 它是30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1 ～ 2μm的多孔硅膠。由于固定相僅是表面很薄一層，因此，傳質(zhì)速度快，加之是直徑很小的均勻球體，裝填容易，重現(xiàn)性好，現(xiàn)已廣泛使用！ 但表面積小，柱容量低，需用高靈敏度檢測器。,2、固定相

10、,21,,由于液液色譜中流動相參與選擇競爭，因此，對固定液選擇較簡單，只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問題。,（2）固定液,A 強極性固定液β，β′一氧二丙腈 B 中等極性的聚乙二醇 C 非極性的角鯊烷等。,22,為了更好解決固定液在載體上流失問題。產(chǎn)生了化學鍵合固定相。 它是將各種不同有機基團通過化學反應鍵合到載體表面的一種方法，它代替了固定液的機械涂漬，因此它的產(chǎn)生對液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作

11、用，可以認為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個革命性突破。 是目前應用最廣泛的一種固定相。據(jù)統(tǒng)計，約有3/4以上的分離問題是在化學鍵合固定相上進行的。,（4）化學鍵合固定相（CBPC）,23,,A 原理：利用化學反應，使硅膠表面的硅羥基與 各種固定液有機物或有機硅化合物反有 應，將固定相與載體之間形成化學鍵， 采用化學鍵合相的液相色譜稱化學鍵合 相色 譜法。,

12、由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于梯度淋洗，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。由于鍵合到載體表面的官能團可以是各種極性的，因此它適用于種類繁多樣品的分離。,24,B 化學鍵合類型,25,26,此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠—C18H37（ODS，C18）、硅膠—苯基等；流動相是采用極性較強的溶劑，如甲醇—水、乙腈一水、水和無機鹽的緩沖溶液等，由于流動相極性大于固定相極性，稱反相健合相色譜法。,27,,

13、A 它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物；B 采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液為流動相，也可用于分離極性化合物；C 若采用水和無機鹽的緩沖液為流動相，則可分離一些易離解的樣品，如有機酸、有機堿、酚類等。 反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無拖尾色譜峰的優(yōu)點。,28,,這種色譜方法主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。,（3）離子型鍵合相色譜法,以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學鍵合各

14、種離子交換基團，如—SO3H、—CH2NH2、—COOH等時，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相；流動相一般采用緩沖溶液。其分離原理與離子交換色譜類同。,29,,3、流動相,在液液色譜中為了避免固定液的流失。對流動相的一個基本要求是流動相盡可能不與固定相互溶，而且流動相與固定相的極性差別越顯著越好。根據(jù)所使用的流動相和固定相的極性程度。,正相分配色譜: 適用于極性化合物的分離，其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。反相分配色譜

15、： 適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰好相反。,30,三、液一固吸附色譜法(LSAC),液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進行分離的。,1、分離原理 當流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動相分子。同時，當試樣分子（X）被流動相帶入柱內(nèi)，與流動相溶劑分子（S）在固定相表面

16、發(fā)生競爭吸附: X + n S吸附= X吸附 + nS,31,,其中K為吸附平衡常數(shù)，K值大表示組分在吸附劑上保留強，難于洗脫。K值小,則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。K值可通過吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。,達平衡時，有：,32,,2、固定相,吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強弱不同的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等。等。由于硅膠的優(yōu)點較多，因此，以硅膠用得最多。,33,,

17、一般把液-固吸附色譜中流動相稱作洗脫劑。在吸附色譜中對極性大的試樣往往采用極性強的洗脫劑；對極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。,3、流動相,34,,四、離子交換色譜法（IEC）,利用離子交換原理和液相色譜技術的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進行分離。它不僅適用無機離子混合物的分離，亦可用于有機物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應用范圍較廣。,1、離子

18、交換原理,離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相離子交換劑交換能力的差別來實現(xiàn)分離的。,35,固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團和可游離的平衡離子。待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進行可逆交換。,2、離子交換固定相,36,,陽離子交換：,陰離子交換：,一般形式：,離子交換反應：,37,,固定相基質(zhì)大致有三大類：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。 離子交換劑又有陽離子和陰離子之分。再根據(jù)官

19、能基的離解度大小還有強弱之分（見下表）,,38,,3、離子交換色譜流動相,離子交換色譜法所用流動相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強度）水的緩沖溶液。 通過改變流動相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。,分離有機酸和有機堿時，這些酸堿的離解程度可通過改變流動相的pH值來控制。增大pH值會使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低pH值，其結(jié)果相反。但無論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會使樣品的保留增大。,3

20、9,五、離子色譜法（IC）,離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。1、離子交換色譜法對無機離子分離檢測的困難 在普通離子交換法中，對于那些不能采用紫外檢測器的被測離子，如采用電導檢測器，由于被測離子的電導信號被強電解質(zhì)流動相的高背景電導信號掩沒而無法檢測，因而，離子交換色譜法在無機離子的分析和應用受到限制。,40,為了解決這一問題，1975年Small等人提出一種能同時測定多種無機和有機離子的新技術。他們在離子交

21、換分離柱后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹脂。通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導的流動相轉(zhuǎn)變成低背景電導的流動相。,2、離子色譜法原理 以離子交換樹脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動相，利用抑制柱消除流動相強電解質(zhì)對測量影響，以電導檢測器檢測組分信號的色譜分析方法。,41,例如對于陰離子分析，色譜柱內(nèi)為陰離子交換樹脂，在流動相中，待測陰離子（如Br-）與陰離子交換樹脂上的OH-離子交換：,交換,42

22、,在陰離子分析中，最常見的洗脫液是NaOH ，洗脫過程中，OH-離子從分離柱的陰離子交換位置置換出待測陰離子Br-。當待測陰離子從柱中被洗脫下來進入檢測器電導池時，要求能檢測出洗脫液中電導的改變。但洗脫液中OH-離子的濃度要比試樣中陰離子濃度大得多才能使色譜柱正常工作。因此，與洗脫液的電導值相比，由于試樣離子進入洗脫液而引起的電導的改變非常小，因而，用電導檢測器直接檢測試樣中離子的靈敏度極差。,43,若在色譜柱中，設立一個抑制柱，抑制柱

23、中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹脂。通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導的流動相轉(zhuǎn)變成低背景電導的流動相。 上例分析中，若使分離后的洗脫液通過填充有高容量H+型陽離子交換樹脂的抑制柱，則在抑制柱將發(fā)生如下反應：,44,可見，從抑制柱中流出的洗脫液中，洗脫液（NaOH）已經(jīng)變成電導很小的水，消除了本底的影響；試樣陰離子則轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳乃?，由于H+的離子趟度很大，所以，大大提高了電導檢測的靈敏度。,3、離子色譜法裝置

24、,45,46,4、離子色譜法優(yōu)點,雙柱；薄殼型陰離子交換樹脂分離柱(3×250 mm),流動相：0.003mol·L-1 NaHCO3 / 0.0024 mol·L-1 Na2CO3，流量138 mL/h。 七種陰離子在20 min內(nèi)基本上得到完全分離，各組分含量在3～50 ppm。,47,,48,離子對分配機理： 離子對色譜的分離機理主要是離子對分配機理;假如有一離子對色譜體系，固定

25、相為非極性鍵合相，流動相為水溶液;在流動相中加入一種電荷與待分離組分離子X+帶相反的對離子Y-，則組分離子X+與對離子Y-首先形成離子對化合物X+ Y-，然后在固定相和流動相中分配：,49,由于離子對化合物X+ Y-具有疏水性，因而被非極性固定相提取。組分離子的性質(zhì)不同，它與反離子形成離子對的能力大小不同以及形成的離子對疏水性質(zhì)不同，導致各組分離子在固定相中滯留時間不同，因而出峰先后不同。這就是離子對色譜法分離的基本原理。,50,平衡

26、常數(shù)：,51,正相離子對色譜法：極性疏水性固定相，非極性流動相；,反相離子對色譜法：這種色譜法的固定相采用非極性的疏水性化學鍵合固定相［如十八烷基鍵合相（ODS）等］，流動相為加有平衡離子（反離子）的極性溶液（如甲醇一水或乙睛一水）。,鍵合相反相離子對色譜法操作簡便，只要改變流動相的pH值、平衡離子的濃度和種類，就可在較大范圍內(nèi)改變分離的選擇性，能較好解決難分離混合物的分離問題。此法發(fā)展迅速，應用較廣泛。,52,,七、凝膠色譜法（SEC

27、）,1、定義： 基于試樣中組分分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離的色譜分析方法，稱凝膠色譜法，又名尺寸排阻色譜法，主要用于較大分子的分離。,53,凝膠: 指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體?？煞譃檐浶?、半剛性和剛性凝膠三類：,（1）軟性凝膠 具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動相，一般用于小分子質(zhì)量物

28、質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。 如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠,54,（2）半剛性凝膠 比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機溶劑作流動相。用于高效液相色譜時，流速不宜大。 如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）,（3）剛性凝膠 溶脹性最差。它們既可用水溶性溶劑，又可用有機溶劑作流動相，可在較高壓強和較高流速下操作。一般控制壓強小于7MPa，流速＜1cm3

29、83;s-1；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分離。 如多孔硅膠、多孔玻璃等。,55,A 凝膠色譜譜所選用的流動相必須能溶解樣品，同時必須能溶脹凝膠。B 流動相的粘度要小。C 所選擇的流動相還必須與檢測器相匹配。D 以水溶液為流動相的凝膠色譜適用于水溶性樣品，以有機溶劑為流動相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。,3、凝膠色譜流動相,常用的流動相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。,56,(1)保留時間是分子尺寸的函數(shù)

30、，有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息；(2) 保留時間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較 低的檢測器；(3) 固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子 基本不保留分子，因此柱壽命長；(4) 不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質(zhì)量 差別必須大于10％才能得以分離。,4、凝膠色譜的特點,凝膠色譜被廣泛應用于大分子的分級，即用來分析大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布。它具有其他液相色譜所沒有的特點：,57,,八、高效液相

31、色譜流動相,一、流動相分類 1、按組成不同可分為單組分和多組分； 2、按極性可分為極性、弱極性、非極性；,二、常用溶劑: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。,58,由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力，并參與固定相對組分的競爭。因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。,（1）溶劑對于待

32、測樣品，必須具有合適的極性和良 好的選擇性。（2）溶劑要與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。所謂溶劑的紫外截止波長指當小于截止波長的輻射通過溶劑時，溶劑對此輻射產(chǎn)生強烈吸收，此時溶劑被看作是光學不透明的，它嚴重干擾組分的吸收測量。下表列出了一些常用溶劑的紫外截止波長。,三、對流動相溶劑的要求：,59,（3）純度要高。由于高效液相色譜靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引

33、起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。,60,（4）化學穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應或聚合的溶劑。（5）粘度要低。若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離。,61,§3–6 高效液相色譜儀,五大部分：高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理與輸出系統(tǒng)。,一、儀器基本組成,62,工作過程如下：

34、首先高壓泵將貯液器中流動相經(jīng)過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當注入待分離的樣品時，流經(jīng)進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。,63,二、各部分功能簡介,1、高壓輸液系統(tǒng) 包括溶劑貯存器、高壓輸液泵、梯度洗脫裝置和壓力表等組成。,（1）溶劑貯存器：由玻璃、不銹鋼、聚四氟乙烯 塑料等制成容量1～2 L容器，用于貯存足夠

35、 數(shù)量、符合要求的流動相。,64,,B 對高壓輸液泵的要求：,（2）高壓輸液泵,A 作用：將溶劑貯存器中的流動相以高壓形式連續(xù) 不斷地送入流路系統(tǒng)，它是HPLC的關鍵 部件，要求壓力：150～450×105 Pa。 。,65,恒流泵：在一定操作條件下，輸出流動相流量保 持恒定，而與色譜柱引起阻力變化無關；,恒壓泵：能保持輸出壓力恒定，但其流

36、量則隨色 譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重現(xiàn) 性差。,它們各有優(yōu)缺點。目前恒流泵比恒壓泵優(yōu)越，使用較普遍,恒流泵分機械注射泵和機械往復泵兩種。,C 高壓輸液泵類別,66,67,,2、進樣系統(tǒng),高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30 cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應）較突出。 柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。進樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主

37、要因素，因此高效液相色譜法中對進樣技術要求較嚴。,68,,（4）六通閥進樣裝置工作示意圖,69,70,3、分離系統(tǒng)——色譜柱,71,,72,A 溶劑要脫氣，溶劑和樣品應過濾， 防止堵塞。B 更換流動相要漸變。C 用后要清洗。D 不用時要保存好。,（4）使用色譜柱注意事項：,73,,4、檢測系統(tǒng),（1）作用：將色譜柱流出組分進行檢測，并將濃 度或質(zhì)量信號轉(zhuǎn)變成電信號輸出。,（2）要求：A 靈敏度高；

38、 B 穩(wěn)定性好； C 線性范圍寬； D 死體積?。?E 對流動相流量變化不敏感。,74,是HPLC中應用最廣泛的檢測器。它的原理基于待測組分對特定波長的紫外或可見光的選擇性吸收，試樣濃度與吸光度的關系服從朗伯-比爾定律。,A 紫外光度檢測器（UV）,優(yōu)點：靈敏度高，選擇性好，對流

39、量和溫度的變化不敏感，適用于梯度淋洗，線性范圍寬，適用于痕量分析。最小檢測量10-9g·mL-1。,（3）常用的高效液相色譜檢測器,75,缺點：只適用于檢測能吸收紫外、可見光的物質(zhì)，流動相選擇受限制。要求流動相在測定波長下無吸收。,76,77,78,79,,C 示差折光率檢測器,檢測器是一種通用型檢測器。它的作用原理是純流動相與包含樣品的流動相之間的折射率不同，檢測器把這種差值檢測出來，給出信號，信號的大小與樣品含量成正比。

40、純流動相與待測組分的折射率相差越大，檢測器靈敏度越高，靈敏度可達10-7g·cm-3。 通用性強，不破壞樣品，線性范圍寬。主要缺點是靈敏度低，不適宜痕量分析，對溫度變化敏感，并且不能用于梯度淋洗。,80,D 熒光檢測器E 電導檢測器 F 化學發(fā)光檢測器,81,它包括脫氣、梯度淋洗、溫控、自動進樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置。其中梯度淋洗裝置是高壓液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置 。,5、高效液相色譜附屬系統(tǒng),（1）什么

41、是梯度洗脫？,在流動相中，使用兩種或兩種以上不同性質(zhì)的溶劑，使其按一定程序改變配比，從而使流動相極性、pH、離子強度相應變化，達到改變待分離樣品的選擇因子和保留時間，提高分離效果和分析速度的目的。,HPLC梯度淋洗與GC中的程序升溫類似。,82,（2）梯度洗脫分類,外梯度洗脫（低壓梯度）: 通過比例調(diào)節(jié)閥，將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例先混合后，再用高壓輸液泵壓入色譜柱系統(tǒng)（只需一臺泵）。,內(nèi)梯度洗脫（高壓

42、梯度）: 兩種或多種流動相分別用泵加壓后，按一定比例混合，再輸入色譜柱系統(tǒng)（需二臺甚至多臺泵）。,83,84,§3–7 色譜分離方法類型的選擇,一、色譜分析方法選擇的依據(jù),1、分析樣品的性質(zhì)：相對分子量；化學結(jié)構(gòu)；極 性；溶解度等。,2、液相色譜分離類型的特點：液-固；液-液；離子 交換；離子對色譜；離子色譜等。,3、實驗室具體條件。,8

43、5,二、相對分子質(zhì)量與色譜分析方法選擇,一般而言：氣相色譜：相對分子質(zhì)量 2000。,三、液相色譜分析類別選擇,86,87,§3–8 高效液相色譜法應用示例,88,89,2. 稠環(huán)芳烴的分析,稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。,固定相：十八烷基硅烷化鍵合相 流動相：20%甲醇-水 ～100%甲醇線性梯度淋洗， 2%/min 流 速：1mL/min 柱 溫：50 ºC 柱

44、 壓：70 ?104 Pa 檢測器：紫外檢測器,90,91,§3–9 液相制備色譜（Preparative Liquid Chromatography）,一、什么是制備色譜？ 采用色譜分離技術分離、獲得高純物質(zhì)（色譜純）的方法。二、液相色譜是理想的制備色譜1、液相色譜分離條件溫和；2、分離檢測過程不破壞樣品；3、分離后產(chǎn)品易于回收。,92,三、色譜柱的柱容量（柱負荷） 對分析柱：

45、不影響柱效時的最大進樣量； 對制備柱：不影響收集物純度時的最大進樣量； 超載：進樣量超過柱容量，柱效迅速下降，峰變寬。 超載可提高制備效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%為宜。,四、液相制備色譜的方法 例如：分離樣品中的微量或痕量組分時：,93,產(chǎn)物為兩主成分之間的小組分 改變色譜條件，使色譜柱超載分離切分，使待分離組分成為主成分（富集）后，再次分離制備,94,五、制備型液相色

46、譜,結(jié)構(gòu)與分析型一樣，但泵流量大、進樣量大、采用制備柱；柱后餾分收集器。 制備柱：內(nèi)徑20～50 mm，柱長50 cm。,95,§3–10 毛細管電泳（Capillary Electrophoresis，CE）,一、概述,在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實現(xiàn)分離。,96,1937年

47、，Tiselius(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白； 并發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定； 第一次的自由溶液電泳；第一臺電泳儀； 1948年，獲諾貝爾化學獎；,97,二、經(jīng)典電泳分析,利用電泳現(xiàn)象對某些化學或生物物質(zhì)進行分離分析的方法和技術叫電泳法或電泳技術。 按形狀分類：U型管電泳、

48、柱狀電泳、板電泳； 按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳；,傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。,1981年，Jorgenson和Luckas，用75 µm內(nèi)徑石英毛細管進行電泳分析，柱效高達40萬/m，促進電泳技術發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術——高效毛細管電泳。,98,三、高效毛細管電泳,高效毛細管電泳在技術上采取了兩項重要