乙醇型發(fā)酵群落分析及產(chǎn)乙醇桿菌功能基因表達(dá)研究.pdf

1、發(fā)酵法生物制氫技術(shù)利用有機(jī)廢水發(fā)酵產(chǎn)生氫氣，不單消耗了有機(jī)廢物而且產(chǎn)生了可被利用的氫氣。一直以來，研究人員采用了多種方式提高產(chǎn)氫效率，如優(yōu)化反應(yīng)器設(shè)計(jì)和操作條件、定向馴化發(fā)酵產(chǎn)氫微生物種群、分離高效產(chǎn)氫細(xì)菌、投加產(chǎn)氫促進(jìn)劑等。氫化酶作為產(chǎn)氫代謝的關(guān)鍵功能酶，與產(chǎn)氫細(xì)菌的代謝末端釋氫過程有著重要的聯(lián)系，而成為產(chǎn)氫研究的熱點(diǎn)；通過調(diào)節(jié)氫化酶的表達(dá)和酶活性，可以促進(jìn)產(chǎn)氫細(xì)菌釋放氫氣。以產(chǎn)氫代謝功能酶為研究主體，分析厭氧發(fā)酵群落結(jié)構(gòu)，揭示產(chǎn)氫細(xì)

2、菌受環(huán)境因子擾動的分子機(jī)制，對提高發(fā)酵產(chǎn)氫系統(tǒng)的產(chǎn)氫能力，深入了解乙醇型產(chǎn)氫細(xì)菌的特殊代謝類型，有重要的現(xiàn)實(shí)意義和理論價值。
　　本研究利用16SrRNA基因和氫化酶基因克隆文庫技術(shù)比較了不同前處理方式獲得的發(fā)酵產(chǎn)氫群落中功能菌群分布的差異。經(jīng)加熱處理的活性污泥呈現(xiàn)丁酸型發(fā)酵，主要優(yōu)勢菌為梭桿菌屬，多個菌種同時存在；未前處理的污泥形成乙醇型發(fā)酵，哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌占絕對優(yōu)勢。不同氫化酶兼并引物設(shè)計(jì)時所選擇的保守區(qū)域或兼顧的細(xì)菌，及目

3、標(biāo)片段長度的不同，會導(dǎo)致其擴(kuò)增相同發(fā)酵樣品結(jié)果有明顯差異；設(shè)計(jì)擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性更高的兼并引物，或同時使用多組引物進(jìn)行擴(kuò)增，可以保證群落分析結(jié)果更為真實(shí)。
　　擴(kuò)增獲得了哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌的[FeFe]-氫化酶基因，開放閱讀框全長1743 bp，編碼580個氨基酸，GenBank注冊號為DQ177326。構(gòu)建了該氫化酶基因異源表達(dá)載體pET28a-hydA，在大腸桿菌BL21中實(shí)現(xiàn)了異源超量表達(dá)，為構(gòu)建基因工程菌株打下基礎(chǔ)。在多重比對

4、中發(fā)現(xiàn)了氫化酶蛋白三個新的保守區(qū)域。
　　基于已有技術(shù)，優(yōu)化了適于哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌等分泌大量胞外聚合物的細(xì)菌的總RNA提取方法。設(shè)計(jì)了哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌hydA II、AK、ADH I、ADH II、LDH基因和拜氏梭菌hydA基因的定量PCR引物，構(gòu)建了包括哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌hydA I基因在內(nèi)的7個功能基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。
　　通過批次培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，考查了不同F(xiàn)e2+、Mg2+、L-半胱氨酸濃度對哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌YUAN-3細(xì)胞生長

5、和產(chǎn)氫能力的擾動。投加適量的三種物質(zhì)可以提高細(xì)胞生長和細(xì)菌產(chǎn)氫能力，最適濃度分別為：FeSO4·7H2O80 mg/L、MgCl2·6H2O600 mg/L和L-半胱氨酸800 mg/L，與之前的研究結(jié)果基本吻合。
　　采用熒光定量PCR技術(shù)，建立了Fe2+、Mg2+、L-半胱氨酸對菌株YUAN-3產(chǎn)氫能力影響和產(chǎn)氫功能基因表達(dá)的偶聯(lián)關(guān)系。Fe2+和L-半胱氨酸對產(chǎn)氫的促進(jìn)作用通過促進(jìn)細(xì)胞生長和功能基因表達(dá)共同實(shí)現(xiàn)。Mg2+對YU

6、AN-3的產(chǎn)氫的促進(jìn)作用主要通過促進(jìn)細(xì)胞生長實(shí)現(xiàn)，對產(chǎn)氫功能基因的表達(dá)有限制作用。6個功能基因的表達(dá)受三種因子的擾動各不相同。hydA I和ADH I的拷貝數(shù)始終是hydA II和ADH II這兩個基因表達(dá)量的100倍左右。
　　Fe2+、Mg2+、L-半胱氨酸對丁酸型發(fā)酵的拜氏梭菌RZF-1108和乙醇型發(fā)酵的哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌YUAN-3的細(xì)胞生長和氫氣產(chǎn)量，及氫化酶基因表達(dá)的擾動不同。少量的Fe2+對兩株細(xì)菌的細(xì)胞生長、產(chǎn)氫和