纖維素酶基因工程菌構(gòu)建及水稻秸稈原位糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇.pdf

1、由纖維素和木聚糖等構(gòu)成的木質(zhì)纖維素是地球上存量最大的可再生資源，木質(zhì)纖維素糖化及生物乙醇的開發(fā)對(duì)于降低對(duì)化石能源依賴，保護(hù)環(huán)境具有重大意義。提高纖維素酶活性以及乙醇發(fā)酵工藝改進(jìn)仍然是第二代生物乙醇的主要研究內(nèi)容。本研究將具有β-內(nèi)切葡聚糖酶、β-外切葡聚糖酶和木聚糖酶活性的福壽螺纖維素酶基因sestc，通過遺傳手段分別整合入黑曲霉和釀酒酵母細(xì)胞中，研究sestc基因在細(xì)胞中表達(dá)及特性，采用同步糖化發(fā)酵技術(shù)研究纖維素原位糖化和乙醇生產(chǎn)，主

2、要結(jié)果如下:
　　(1)黑曲霉基因工程菌的構(gòu)建及纖維素酶研究。通過限制性內(nèi)切酶酶切和T4 DNA連接酶連接的方法構(gòu)建整合型真核表達(dá)載體gpF-sestc，此表達(dá)載體包含gpd-Fvs啟動(dòng)子和潮霉素B抗性篩選標(biāo)記hpt，通過原生質(zhì)體和PEG/CaCl2介導(dǎo)的方法將目的基因整合進(jìn)入黑曲霉中;經(jīng)過PCR篩選、透明圈篩選和SDS-PAGE檢測，篩選出產(chǎn)酶活最高的基因工程菌A.niger No.17，經(jīng)搖瓶液態(tài)發(fā)酵，A.nigerNo.17

3、產(chǎn)纖維素酶的濾紙酶活、內(nèi)切葡聚糖酶活、外切葡聚糖酶活和木聚糖酶活分別達(dá)到1.736±0.051 U/mL、16.225±0.91 U/mL、17.727±0.851U/mL、30.165±0.54 U/mL，比野生型菌株提高了1.21、1.37、1.25和1.3倍;比較不同碳源對(duì)酶活的影響，產(chǎn)酶效率最高的為經(jīng)堿性氧化預(yù)處理的水稻秸稈，發(fā)酵4d后產(chǎn)FPA達(dá)到1.476±0.021U/mL。
　　(2)釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建及纖維素

4、酶表達(dá)。分別將含有g(shù)pd-Fvs和gpd-Shi兩種啟動(dòng)子的表達(dá)載體，通過原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化入釀酒酵母基因組中，通過PCR篩選、RT-PCR和透明圈篩選獲得產(chǎn)纖維素酶活最高的工程菌株S.cerevisiae No.14，F(xiàn)vs-gpd啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)效果高于Shi-gpd啟動(dòng)子;以麩皮為底物搖瓶發(fā)酵時(shí)，轉(zhuǎn)化子No.14發(fā)酵48 h后的總纖維素酶活(FPA)達(dá)到最高，為1.1 U/mL，比野生菌提高27.5倍;No.14分泌β-內(nèi)切葡聚糖酶活、

5、β-外切葡聚糖酶活和木聚糖酶活分別達(dá)到378 U/mL、1.44 U/mL和164 U/mL.No.14纖維素酶粗酶液酶學(xué)性質(zhì)研究表明，最適反應(yīng)溫度和pH分別為50℃和pH5，不同的金屬離子及其濃度對(duì)于酶活有不同程度的抑制或激活作用。
　　(3)黑曲霉和釀酒酵母基因工程菌協(xié)同生產(chǎn)乙醇。A.niger No.17固態(tài)發(fā)酵水稻秸稈，工程菌降解底物能力高于野生菌，經(jīng)預(yù)處理過的水稻秸稈發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活力較高且更容易被降解;將工程菌A.ni

6、ger No.17和S.cerevisiae No.14結(jié)合，通過原位產(chǎn)酶及同步糖化發(fā)酵工藝，乙醇產(chǎn)量為9.71 g/100g水稻秸稈，比野生菌提高16.8％。
　　整合sestc基因的黑曲霉和釀酒酵母基因工程菌整體纖維素酶性能得到提高，協(xié)同依次發(fā)酵有利于實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素底物水解和發(fā)酵的同步，提高乙醇產(chǎn)率，簡化纖維素乙醇生產(chǎn)工藝。本研究從纖維素酶基因工程菌的結(jié)合以及協(xié)同依次發(fā)酵方面為第二代生物乙醇（纖維素乙醇）開發(fā)可行性提供參考，同