醇脫氫酶A在嗜熱厭氧乙醇桿菌乙醇代謝中的功能.pdf

1、醇脫氫酶A(AdhA)是高溫厭氧細(xì)菌乙醇代謝途徑中的一種關(guān)鍵酶。在對(duì)高溫厭氧細(xì)菌纖維素乙醇發(fā)酵研究工作中因?yàn)槭葻釁捬跻掖紬U菌(The rmoanaer-obacter ethanolicus)擁有代謝速度快、水解纖維素能力強(qiáng)、戊糖轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)而獲得了研究人員的較大的關(guān)注。
　　本文以來(lái)源于嗜熱厭氧乙醇桿菌JW200中的醇脫氫酶A基因adhA為研究對(duì)象。構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pHsh-adhA和穿梭載體pTE-o ri-adhA和pTE

2、-ori-adhE-adhA。在E.coli DH10B內(nèi)得到表達(dá)的AdhA，通過(guò)DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析和Cibacron Blue3GA Agarose親和層析兩步純化后得到純酶，純化的AdhA在SDS-PAGE膠上為單一電泳條帶。通過(guò)對(duì)AdhA酶學(xué)性質(zhì)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn):AdhA催化乙醛到乙醇的最適溫度為60℃，最適pH為7.79，但當(dāng)溫度高于65℃或pH大于8.0酶的活性急劇下降;AdhA催化乙醇

3、到乙醛的最適溫度為70℃，最適pH為5.0，但當(dāng)溫度高于85℃或pH低于4.0和大于6.0時(shí)酶的活性急劇下降;AdhA在5.8～7.2的pH范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，相對(duì)活性均保持在80％以上，而當(dāng)pH高于7.5則很不穩(wěn)定;在45℃和50℃時(shí)酶的穩(wěn)定性都很高，溫育2h后仍保留80％以上的相對(duì)活性，55℃下的半衰期約為1 h;Zn2+能顯著提高AdhA的活性，而Cu2+，F(xiàn)e3+和SDS對(duì)酶的活性有較強(qiáng)的抑制作用。
　　在最適條件下，AdhA

4、有著明顯的醇脫氫酶活性（即催化乙醛到乙醇的可逆反應(yīng)），實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)AdhA的催化特性:乙醛到乙醇反應(yīng)活性(比酶活為10.88±0.20U/mg)比乙醇到乙醛反應(yīng)的活性(比酶活為8.32±0.14 U/mg或8.72±0.18 U/mg)要高，這說(shuō)明AdhA起到促進(jìn)乙醇產(chǎn)生的作用;乙醇的濃度的升高(20 mmol/L到1％)導(dǎo)致乙醇到乙醛的反應(yīng)活性的增強(qiáng)(8.32±0.14 U/mg到8.72±0.18 U/mg);說(shuō)明隨著乙醇的濃度的升

5、高，AdhA消耗乙醇的能力越強(qiáng)。在生理?xiàng)l件下，因?yàn)槭軠囟取H、底物與輔酶濃度等眾多因素的限制，AdhA主要表現(xiàn)出乙醇到乙醛反應(yīng)活性，而只有微弱的乙醛到乙醇反應(yīng)活性，也就是說(shuō)主要起消耗乙醇的作用;隨著乙醇濃度的升高AdhA催化乙醇到乙醛的活性也增強(qiáng)，當(dāng)乙醇濃度為2mmol/L時(shí)AdhA催化乙醇到乙醛反應(yīng)的比酶活分別為0.27±0.01U/mg(pH7.2)和0.17±0.0 U/mg(pH6.6)，而當(dāng)環(huán)境中的乙醇達(dá)到一定濃度的時(shí)候(乙