生物學常用培養(yǎng)基

1、病原物的分離與培養(yǎng)病原物的分離與培養(yǎng)病原物的分離與培養(yǎng)一、實驗目的1學會制作普通的培養(yǎng)基。2掌握病原物分離、培養(yǎng)和純化的一般方法。二、講解要點柯赫氏法則（KochsPostulate）是通過一系列步驟確定引起病害的病原物的原則和方法，是診斷病害中的證病律。其基本步驟如下：1在染病組織上用顯微鏡經(jīng)常檢查到某種微生物；2從病組織中分離得到該微生物，并獲得純培養(yǎng)；3將純培養(yǎng)的微生物接種到健康的感病寄主植物后，發(fā)生原先觀察到的癥狀；4從接種發(fā)病

2、的組織中，再分離，又得到相同的微生物。全過程擬分兩次實驗完成，本次完成第一和第二步。包括培養(yǎng)基的制作和病原物的分離、培養(yǎng)及純化。（一）培養(yǎng)基的制作真菌和細菌等微生物與其他生物一樣，生長和發(fā)育都需要一定的營養(yǎng)條件。不同類群的微生物對營養(yǎng)條件的要求不同。因此，在人工培養(yǎng)微生物時，就必須考慮它們的營養(yǎng)要求。培養(yǎng)基就是按照微生物生長，繁殖所需的各種營養(yǎng)物質，用人工的方法配制的基質。1常用培養(yǎng)基的配制植物病理實驗室所用的培養(yǎng)基與一般微生物培養(yǎng)基大

3、致相同，只是植物質培養(yǎng)基用得多些。（1）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基這是使用最頻繁的培養(yǎng)基，簡稱PDA，主要用于真菌的分離和培養(yǎng)，有時也用于植物病原細菌的培養(yǎng)。配方為：馬鈴薯200g葡萄糖（蔗糖）10～20g瓊脂17～20g水1000mL配制方法：將新鮮的馬鈴薯洗凈、去皮，（注意：發(fā)霉、變綠的不要使用。）切成薄片或蠶豆大小的方塊，稱取所需的重量，倒入鍋內(nèi)，加水1000mL煮沸半小時左右，至馬鈴薯酥而不爛為止，用四層紗布過濾，然后將事先稱好的瓊

4、脂加到上述濾液中，用小火加熱，使之慢慢融化，并用玻棒不斷攪拌，以免燒焦鍋底。再加入事先用溫水溶化的糖溶液，用二層紗布過濾。測定pH值，用1molL的NaOH或HCl調至pH為5.5～6.5之間，最后加水補足至1000mL。實驗中使用的水，一般情況下并不要求用蒸餾水，只要水比較潔凈，沒有有害物質就可以了，硬水（井水）含有較多的鈣鎂離子，配制的培養(yǎng)基沉淀較多，最好避免使用。（2）肉汁胨培養(yǎng)基肉汁胨培養(yǎng)基主要用于細菌的分離和培養(yǎng)?？梢耘涑膳囵B(yǎng)

5、液體或瓊脂培養(yǎng)基使用，配方為：牛肉浸膏3g蛋白胨5～10g水1000mL將稱好的牛肉浸膏和蛋白胨溶于水中，酸度調至pH7，分裝滅菌。每1000mL肉汁胨培養(yǎng)液中加瓊脂17～20g，加熱，充分攪勻，冷卻即配成固體培養(yǎng)基。（3）植物組織和煎汁許多植物材料如豆莢、莖稈、種子等，可以放在試管中，加少量水份以保持濕潤，滅菌后即能做培養(yǎng)基使用。植物煎汁是很好的培養(yǎng)基，可以滿足普通微生物的營養(yǎng)需要，各種植物的煎汁都可用作培養(yǎng)液，如加瓊脂即能制成固體培

6、養(yǎng)基。當然，必須滅菌后才能使用。馬鈴薯斜面的制作：用木塞穿孔器切取直徑比試管直徑略小的柱狀薯塊，將馬鈴薯塊切成將升汞溶于濃鹽酸中，待其充分溶解后，用水稀釋。升汞劇毒、無色，為便于認識，可在溶液中加幾滴紅染料。消毒時間因材料質地、發(fā)病部位深淺及污染情況而異，一般3～5分鐘。消毒后用無菌水沖洗3～4次。（2）漂白粉消毒液有些真菌對汞、銅等金屬離子敏感，可用漂白粉消毒液。其配方為：漂白粉10g，水140mL。選用新鮮漂白粉，將漂白粉溶于水中，

7、過濾后使用，隨用隨配，不能久留，否則因揮發(fā)而失去殺菌能力。一般處理3～5分鐘，消毒時間亦因材料而異，處理種子用5～10分鐘。消毒后用無菌水沖洗，有時也可不必沖洗。（3）酒精和其它消毒劑70%酒精也是常用的表面消毒液。將材料在酒精溶液中浸數(shù)秒鐘到一分鐘，然后水洗。有些幼嫩組織只需用脫脂棉蘸酒精溶液少許，擦涂表面，待酒精揮發(fā)后，即可放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。對于特別幼嫩的病組織，因對藥物敏感，可以用滅菌水洗8～9次。4分離方法常用的分離方法分為兩大

8、類：（1）組織分離法：分離一小塊染病組織，經(jīng)表面消毒后，移植于平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)。很多材料適用此法，下面介紹幾種：斑點病病原菌的分離：挑取新鮮典型的病斑，在病健交界處，剪取5mm2的染病組織，在70%酒精中浸數(shù)秒鐘，然后移入0.1%的升汞溶液中處理3～5分鐘，用無菌水沖洗3次，移入平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)。維管束病菌的分離：先用70%的酒精將根莖表面擦拭消毒，然后用滅過菌的解剖刀剝?nèi)ケ砥?，再切取其中一小塊變色的部分，用升汞液或漂白粉液消毒，用無菌

9、水沖洗幾次后，移到培養(yǎng)基上培養(yǎng)。種子內(nèi)病原菌的分離：用升汞溶液或漂白粉溶液進行種子表面消毒，然后用無菌水沖洗，再移于平板培養(yǎng)基上。（2）稀釋分離法用無菌水從發(fā)病組織表面沖下孢子，配成孢子懸浮液，用無菌移液管或滴管吸取一定體積的菌液至平板培養(yǎng)基上，然后用無菌玻璃棒將菌液輕輕的均勻涂布在整個平板上，或將菌液移至無菌培養(yǎng)皿中，然后傾入融化后冷卻至45℃的培養(yǎng)基，輕輕振蕩、平置、凝固后倒置培養(yǎng)。并在皿蓋上寫上日期、分離物名稱、分離者姓名。分離工

10、作有時并不順利，要從分離材料、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及操作處理方法等方面找原因，改變工作方法，不斷進行試驗（三）菌種的純化按照上述步驟分離病原物，如果材料很新鮮，本身很少污染，有可能一次分離出純培養(yǎng)菌。然而多數(shù)情況下會發(fā)現(xiàn)同一培養(yǎng)皿中有不同的菌落，要做菌種的純化。純化的方法很多，下面介紹三種方法。1瓊脂平板稀釋純化法將菌種上產(chǎn)生的孢子用無菌水沖洗下，在無菌培養(yǎng)皿中適當稀釋后（大致每個培養(yǎng)皿中只有30個左右的孢子），取一定量的孢子懸浮液與融化后