光合細(xì)菌降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留物研究.pdf

1、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是具有高效生物活性的一大類殺蟲劑，具有殺蟲譜廣、對(duì)溫血?jiǎng)游锒拘缘偷忍攸c(diǎn)，在我國(guó)被廣泛用于糧食、蔬菜和果樹等多種作物防治多種害蟲。長(zhǎng)期大量使用后，該類農(nóng)藥已成為我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品中主要的農(nóng)藥殘留類型之一。
　　 利用水溶性碳二亞胺(EDC)法將甲氰菊酯的合成前體甲氰菊酸(Fenpropathric acid,FA)與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)，合成了甲氰菊酯的免疫半抗原，免疫新西蘭大白兔(New Zealand white

2、 rabbit)獲得了甲氰菊酯多克隆抗體(Polyclonal antibody,PAb)。通過紫外掃描分析，免疫原中甲氰菊酸分子與蛋白質(zhì)分子的偶聯(lián)比為8.8∶1，50％飽和硫酸銨法純化抗體，IC-ELISA(indirect compete enzyme-linked immunosorbent assay)法測(cè)定多克隆抗體效價(jià)達(dá)1∶12800，最適甲氰菊酸-OVA包被抗原質(zhì)量濃度為1.0μg·mL－1；最低檢出限為8.5μg·L－1

3、。以抗體與甲氰菊酯的反應(yīng)率為100％，抗體與其他4種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥交叉反應(yīng)率很低，與溴氰菊酯交叉反應(yīng)較高。結(jié)果表明：制備的甲氰菊酯多克隆抗體具有較高的特異性，建立的IC-ELISA法可用于甲氰菊酯殘留物的檢測(cè)以及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留物降解菌的快速篩選。
　　 采用富集培養(yǎng)，從農(nóng)藥廠廢水中篩選能夠降解多種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留物的穩(wěn)定復(fù)合菌群，測(cè)定其降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留物的特性，采用16S rDNA-RFLP分析該復(fù)合菌群的細(xì)

4、菌結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明：篩選獲得了降解多種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留物的穩(wěn)定厭氧復(fù)合菌群，命名為JZ-1，降解特性結(jié)果表明：最佳降解條件為pH7、30℃；在最佳條件下培養(yǎng)15d，對(duì)100mg·L－1甲氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯的降解率為53.27％、33.36％、41.39％。菌群JZ-1的16S rDNA擴(kuò)增和RFLP及測(cè)序分析結(jié)果表明，復(fù)合菌群JZ-1的16S rDNA的克隆文庫(kù)的庫(kù)容C為93.54％，文庫(kù)的覆蓋程度較高；Shannon-Wi

5、ener多樣性指數(shù)H為1.20，菌群JZ-1含有豐富的細(xì)菌資源；其中的優(yōu)勢(shì)種群包括紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)，紫單孢菌科細(xì)菌(Porphyromonadaceae bacterium)。
　　 在篩選的能夠降解多種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留物的厭氧復(fù)合菌群JZ-1的基礎(chǔ)上，通過IC-ELISA法快速篩選降解效率較高的降解菌，然后劃線分離、單胞培養(yǎng)分離擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留物高效降解菌，生理生化特征結(jié)合16S rDN

6、A序列同源性菌系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定降解菌，氣相色譜法測(cè)定降解菌的降解效率。結(jié)果表明，從厭氧復(fù)合菌群JZ-1分離到四株光合細(xì)菌菌株（命名為：PSB07-6、PSB07-15、PSB07-19、PSb07-21)，4個(gè)菌株初步鑒定為紅假單胞菌(Rhodopseudomonas)。35℃、3000 Lx光照培養(yǎng)15 d，4個(gè)菌株P(guān)SB07-6、PSB07-15、PSB07-19、PSB07-21降解600mg·L－1甲氰菊酯的速率分別為：1.02

7、 mg·d－1、1.48 mg·d－1、1.13 mg·d－1、2.94 mg·d－1。
　　 選擇對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留物降解效率較高的菌株P(guān)SB07-15進(jìn)行降解特性試驗(yàn)，結(jié)果表明：PSB07-15能耐受較高濃度(600 mg·L－1)的甲氰菊酯，降解甲氰菊酯的最適溫度為20-30℃、pH為6.5-7.5、光照強(qiáng)度2000-3000 Lx。PSB07-15在最佳降解條件下，對(duì)600 mg·L－1甲氰菊酯的降解速率為1.87

8、mg·d－1。PSB07-15降解5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留物的效率不一致，能有效的降解聯(lián)苯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和氟氯氰菊酯等4種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留物，對(duì)溴氰菊酯的降解效率不高。PSB07-15以共代謝的方式降解甲氰菊酯，其降解酶屬胞內(nèi)酶。
　　 通過測(cè)定PSB07-15降解甲氰菊酯過程中的pH值變化及GC-MS測(cè)定中間代謝產(chǎn)物，推測(cè)PSB07-15降解甲氰菊酯的機(jī)理。結(jié)果表明：PSB07-15降解甲氰菊酯的過程中，pH變化

9、比較復(fù)雜，1-3 d，pH下降，5-9 d，pH迅速上升，9-15 d，pH逐漸下降；GC-MS檢出PSB07-15甲氰菊酯殘留物的代謝產(chǎn)物間苯氧基苯乙腈，推測(cè)PSB07-15降解甲氰菊酯殘留物的可能方式是作用于甲氰菊酯的酯鍵處。
　　 PSB07-15的生物學(xué)特性研究表明，培養(yǎng)24 h，PSB07-15產(chǎn)生IAA量為1.81±0.09 mg·L－1，ACC脫氨酶活性的比活力為0.35±0.02 U·mg－1。100 mg·L－

10、1的甲氰菊酯對(duì)PSB07-15產(chǎn)IAA(1.02±0.05 mg·L－1)和ACC脫氨酶(0.12±0.01 U·mg－1)活性有抑制作用。PSB07-15能顯著的促進(jìn)玉米胚根的生長(zhǎng)。
　　 為了探索PSB07-15降解甲氰菊酯殘留物的應(yīng)用潛力，在實(shí)驗(yàn)室研究了PSB07-15對(duì)水培黃瓜體系中的甲氰菊酯污染的生物修復(fù)效率。PSB07-15可以有效降解黃瓜營(yíng)養(yǎng)液和黃瓜中的甲氰菊酯殘留物，培養(yǎng)30 d，PSB07-15對(duì)黃瓜營(yíng)養(yǎng)液中1

11、00mg·L－1甲氰菊酯殘留物降解率達(dá)到47.63％，黃瓜中甲氰菊酯殘留物降解率達(dá)59.73％。PSB07-15可以顯著的增加黃瓜的根長(zhǎng)累積增加值以及生物量累積增加值；能夠促進(jìn)黃瓜的根活力值以及根H2O2酶活性，但并不顯著。
　　 選擇菌株P(guān)SB07-21對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留物降解酶基因進(jìn)行了克隆與分析。PSB07-21降解3種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留物的最佳條件分別為3000 Lx、pH7、35℃；在最佳降解條件下培養(yǎng)15 d，

12、PSB07-21對(duì)600 mg·L－1甲氰菊酯、氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯降解率分別為66.63％，43.25％，50.18％。PCR方法從PSB07-21中克隆到一個(gè)1050bp的DNA片段，分析表明該片段包含一個(gè)ORF，該ORF的預(yù)測(cè)蛋白與Burkholderia sp.383的2OG-Fe(Ⅱ)oxygenase的同源性為37.0％。添加0.1 mmol·L－1 Fe(Ⅱ)，可提高菌株P(guān)SB07-21對(duì)甲氰菊酯、氯氰菊酯和聯(lián)苯菊酯的降解效