第六課題魚卵的形態(tài)學(xué)-卵膜掃描電鏡觀察及遺傳學(xué)鑒定的研究

1、魚卵的形態(tài)學(xué)及遺傳學(xué)鑒別的研究,張秀梅 高天翔 卞曉東 肖永雙,2007.5.25,魚卵鑒別的重要意義,環(huán)境影響的評估,魚類的增殖,漁業(yè)資源的解析,魚類的放流,魚類的養(yǎng)殖,,,海洋生態(tài)系統(tǒng)科學(xué)研究的基礎(chǔ)工作,目的意義,,魚卵的鑒別的方法,,(Shao et al.,2002),研究背景,魚卵的形態(tài)學(xué)鑒別,研究背景,,19世紀(jì)，80～90年代漁業(yè)生產(chǎn)迅速發(fā)展（英國 Holt&Mintoch, 德國 Ehrorba

2、um，法國的 Guitel）開始魚卵、仔魚的種類鑒別。二戰(zhàn)后，因各國傳統(tǒng)漁場普遍過渡捕撈，資源瀕臨枯竭，所以用魚卵魚、仔稚魚的調(diào)查資料來估算魚類資源量。（日本的水戶敏，沖山宗雄。美國的Ahlstrom Matarese&Sandknop等）。我國的學(xué)者在上世紀(jì)五、六十年代也對中國近海的主要魚卵、仔魚種類的形態(tài)學(xué)研究做了部分研究工作。(陳真然，張孝威，沙學(xué)紳，何桂芬，張仁齋等)。,迄今為止，絕大多數(shù)魚卵種類的鑒定主要是依靠形態(tài)

3、學(xué)觀察的方法，依據(jù)人工孵化或是連續(xù)觀測的方法獲得的圖鑒和檢索表來進行魚卵種類的鑒別。,魚卵的形態(tài)學(xué)鑒別要點,,,,研究背景,獨立于胚胎的外部特征魚卵的形狀、大小，卵殼的形狀，卵黃的形狀，油球的有無，以及圍卵腔的大小，卵膜絲的有無。,與胚胎發(fā)育相關(guān)的特征如色素的分布，肌節(jié)的數(shù)目，消化道的長短，魚鰭折疊的類型，心臟的位置，在不同發(fā)育階段胚孔關(guān)閉以及孵化程度，發(fā)育后期以及新孵化仔魚的卵黃囊的形狀，油球在卵黃囊中的分布狀態(tài)等,魚卵的形態(tài)

4、學(xué)研究的特點,研究的背景,魚卵階段發(fā)育時間短，形態(tài)變化復(fù)雜，鑒別的形態(tài)特征較少。,許多魚類的產(chǎn)卵期與產(chǎn)卵區(qū)相互交疊,卵的形態(tài)也特別地相似。,要求鑒別者要有較高的魚類分類學(xué)知識積累。,鑒別工作需要消耗大量的時間。,目前已鑒別的魚卵仔稚魚種類（Shao et al,2002）,成魚種類2.7萬種（2002）,世界上目前已鑒別的成魚種類已愈2萬7千余種，而鑒別的仔稚魚數(shù)目為成魚種類的1/10,鑒別的魚卵數(shù)目又僅為已鑒別仔稚魚數(shù)目的1/10。我

5、國海洋魚類3023種。硬骨魚類2786種，有資料可查的魚卵、仔魚種類不過150種。,研究背景,卵膜掃描電鏡觀測,研究背景,不同魚類卵膜的超顯微結(jié)構(gòu)不盡相同，卵膜表面的許多形態(tài)結(jié)構(gòu)可以作為區(qū)分魚類科或?qū)俚男誀?，而在受精?區(qū))結(jié)構(gòu)中可找到種的特征（ Gary et al., 1982 ）。,近30年來，已有不少學(xué)者利用掃描電鏡對魚卵卵膜進行亞（超）顯微結(jié)構(gòu)觀察。以期 發(fā)現(xiàn)魚卵更多的形態(tài)學(xué)鑒別的結(jié)構(gòu)特征。,Sparus sarba（黑鯛）,

6、精孔管壁類型1.螺線形（鲀科、牙鲆、黑鯛）2.肋條狀（鮭屬Salmonid魚卵）3.階梯狀（尼羅羅非魚）,魚卵卵膜受精孔的類型,Fugu obscurus（暗紋東方鲀）(3,1）,無凹陷，長的孔道；螺線形,,魚卵的受精孔分為三種類型（Riehl & Götting,1 974) 1．深的凹陷和短的孔道。 2．淺的凹陷和長的孔道。 3．只有一孔道，無明顯的凹陷。,Sparus sarba（

7、黑鯛）,淺的凹陷和長的孔道,螺線形,淺的凹陷和長的孔道,螺線形,深的凹陷和短的孔道,階梯狀,魚卵的遺傳學(xué)鑒別研究,mtDNA由于其結(jié)構(gòu)簡單，嚴(yán)格的母系遺傳，比核基因進化速度快，不同的區(qū)域進化速度存在差異，允許選擇不同的區(qū)域進行不同時間尺度的進化分析，即便是在最初的發(fā)育階段，在魚卵中也有大量mtDNA的拷貝數(shù)，因此，mtDNA是鑒別魚卵種類的首選分子標(biāo)記。,mtDNA序列分析是鑒別魚卵種類的有效方法之一，可以用mtDNA序列分析和形態(tài)學(xué)鑒

8、別結(jié)果來相互驗證。,,迄今，國內(nèi)尚未見用mtDNA序列鑒別魚卵、仔稚魚的報道。,研究背景,國外研究進展（簡略）,Mork et al.（1983）、Graves et al.（1988）分別用同工酶分析的方法來鑒別魚卵與仔魚。Daniel Ⅲ and Graves（1994）用限制性酶切技術(shù)來鑒別春季產(chǎn)卵的石首魚科的魚卵。Rocha-Olivares（1998）用擴增mtDNA特定區(qū)域的方法來鑒別巖礁魚類的魚卵與仔魚。近年來，操作簡

9、便、結(jié)果直觀的測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用。Shao et al. （2002）用mtDNA的D-loop基因片段序列來鑒別臺灣海域的魚卵，指出只有靠基因序列的比對才能將魚卵準(zhǔn)確鑒別到種。Perez et al. （2005）用mtDNA中的16S rRNA序列來鑒別經(jīng)福爾馬林保存的Merluccius merluccius、Lepidorhombus boscii及L. whiffiagonis魚卵。García-Vá

10、zquez et al. （2006）利用16S rRNA為分子標(biāo)記來鑒別資源調(diào)查時采集的不同種類的魚卵。Pegg et al.（2006）利用線粒體DNA條形編碼來鑒別澳大利亞南部大堡礁海域的仔魚。,研究背景,,,,,DNA條形編碼（DNA barcoding）是對一個統(tǒng)一的目標(biāo)基因DNA序列的分析，達到物種鑒定分類的目的。目前國際上常用的為mtDNA上的16sRNA基因和COⅠ基因。,沙氏下鱵魚魚卵的形態(tài)學(xué)遺傳學(xué)鑒別研究,為了準(zhǔn)確

11、鑒別在南黃海海區(qū)（33°49′N, 122°10′E）利用淺水Ⅰ型浮游生物拖網(wǎng)采集的大量附著在海藻上的魚卵種類，利用光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡和遺傳學(xué)方法對其開展了綜合鑒別研究。,(Hyporhamphus sajori),其常棲息于淺海、河口，有時入淡水。主要分布在西北太平洋，從中國的長江口起，到黃海，渤海，日本海，日本太平洋沿岸一直延伸到庫頁島以及符拉迪沃斯托克港灣附近。在黃渤海海域該魚于5月下旬到6月上旬產(chǎn)卵，其與頜

12、針魚科魚的產(chǎn)卵 期與產(chǎn)卵區(qū)相互交疊，卵的形態(tài)也特別的相似為黃渤海魚卵常見種類 。,沙氏下鱵魚的生態(tài)分布,1.形態(tài)學(xué)觀測（1）（4x10）,,1.魚卵透明，呈微扁圓形，粘著沉性，卵黃間隙狹小，卵徑多在20mm～25mm；,2.多油球數(shù)不定（>20），油徑變化大，在0.10～0.18mm之間，在卵黃囊后位聚集分布，且隨著胚胎發(fā)育，其位置也會發(fā)生很大的變化；卵黃較多，卵黃囊無龜裂，呈乳白色。,,3.卵膜較厚并具有較強的韌性，在上面著生有

13、4～7根細長的角質(zhì)管狀卵膜絲，多為一端著生4根，另一端著生1根，卵藉此細絲彼此纏繞在一起并纏繞在其他物體或海藻上進行發(fā)育。,形態(tài)學(xué)觀測（2）（4x10）,,4.該卵的卵裂和其它硬骨魚類相同,均屬盤狀分裂性，當(dāng)胚盤包卵3/4時，整個胚體即完全成形。,結(jié)論,魚卵與同期在該調(diào)查海域產(chǎn)附著性魚卵的種類，如頜針魚目（Beloniformes）頜針魚科（Belonidae）的扁頜針魚（Ablennes anastomella）、鱵科（Hemirha

14、mphidae）的沙氏下鱵魚、飛魚科（Exocoetidae）的燕鰩魚(Cypselurus agoo)，以及鲀形目（Tetraodontiformes）鲀科(Tetraodontidae)魚類的卵相似。,,魚卵卵徑大，在2.0~2.5mm之間，而鲀科魚類所產(chǎn)卵的卵徑較小，一般在0.85~1.1mm之間。,魚卵卵膜表面動物極端著生4根卵膜絲，在相反方向有1～2根卵膜絲，與扁頜針魚及沙氏下鱵魚相似，而燕鰩魚則具有30～40根。魚卵多油球、

15、數(shù)不定，與沙氏下鱵魚卵相似而扁顎針魚卵不含油球（萬瑞景, 姜言偉, 2000）。,且同一團海草上采集到的魚卵處在不同的發(fā)育期，與陳大剛描述的沙氏下鱵魚為分批產(chǎn)卵類型相吻合。由此根據(jù)魚卵形態(tài)及生態(tài)特征初步推斷其為沙氏下鱵魚卵。,2.魚卵卵膜的掃描電鏡觀測（1）,魚卵受精孔明顯，為淺凹陷、長孔道類型。 受精孔呈漏斗狀(圖3)，由受精孔前庭與精孔管組成。前庭上口緣直徑為12.3μm，下口徑7.3μm。,,魚卵卵膜上的微孔不明顯。魚卵卵膜表面出

16、現(xiàn)大量規(guī)則的顆粒狀突起。密度約為50個/100μm2，直徑在1.95～2.50μm之間。為該種魚卵表面的特異性結(jié)構(gòu)，可以作為該種魚卵種類鑒別的重要依據(jù)。,魚卵卵膜的掃描電鏡觀測（2）,卵膜表面還生有細長管狀角質(zhì)細絲，在動物極端著生4根，其基部較粗，有明顯的起訖點，基部斷裂面外管徑為34.0μm，且卵膜絲管與卵內(nèi)環(huán)境是相通的。,,通過對卵膜破裂卵的卵黃囊表面觀察發(fā)現(xiàn)，其存在規(guī)整的顆粒狀結(jié)構(gòu)。,小結(jié)：由于可供參考的資料不足，無法依據(jù)所得的結(jié)

17、果將魚卵鑒別到種。,3.魚卵遺傳學(xué)鑒別研究,,,,1. Cyt b基因不僅容易用一些通用引物擴增和測序，而且它還是線粒體DNA上唯一的結(jié)構(gòu)和功能被了解的較為清楚的蛋白編碼基因 ，所以，與其它許多脊椎動物一樣，在魚類中Cyt b基因也是分子系統(tǒng)學(xué)研究中應(yīng)用得較多的分子標(biāo)記。,,3.D-loop序列片段以其較高的突變積累對于研究物種內(nèi)的遺傳分化具有重要價值，已成為研究魚類種內(nèi)基因分化最常用的標(biāo)記。,,,2.COI基因為獨立于核基因組以外的環(huán)

18、狀DNA，進化速度快，包含從種內(nèi)到種間的遺傳進化信息, 可用于比較生物體進化之間的相互關(guān)系。,,實驗引物,用于擴增D-loop基因的引物： L15623（5′-CCACCACTAGCTCCCAAAGC-3′） H16174（5′-GAACCTGACGAAGGAACCAGA-3′）,用于擴增Cyt b基因片段的引物為： L14734-Glu（ 5′-AACCACCGTTGTTATTCAACT-3′）

19、 H15149-Cyt b（5′-CTCAGAATGACATTTG TCCTCA-3′）,用于擴增COI 基因序列的引物為： L5956-COI（5′-CACAAAGCATTGGCACCT-3′） H6558-COI（5′-CCTCCTGCAGGGTCAAGAA-3′）,序列用DNAStar軟件包進行拼接、比對，用MEGA (Ver3.1)軟件分析.,比對分析所用的序列種類、拉丁名、英文名、中文名、樣

20、品來源以及處理方法,,,,,,,將測序所得的Cyt b基因片段序列輸入GenBank后，得到的同源序列,1.魚卵Cyt b基因片段序列與其它頜針魚目魚類同源序列變異位點圖譜,,,,,魚卵序列之間，以及魚卵與沙氏下鱵魚序列之間堿基無差異。,,,魚卵與太平洋頜針魚基因片段序列S.a1、S.a2、labS.a之間分別出現(xiàn)48、49、49個堿基差異，差異率在20.42～20.85%之間。,,魚卵與臺灣原尾頜針魚（Strongylura leiu

21、ra）基因序列片段S.l1、S.l2之間分別出現(xiàn)44個堿基差異，差異率為18.72%。魚卵與叉尾頜針魚（Tylosurus acus melanotus）基因序列片段T.a.m1、T.a.m2之間分別出現(xiàn)50、48個堿基差異，差異率在20.43～21.3％之間。,基于Cyt b基因構(gòu)建的魚卵及同源序列和遺傳距離圖,,,,,魚卵之間，以及魚卵與沙氏下鱵魚序列之間無差異。魚卵與其它頜針魚科魚類序列之間的遺傳距離符合Cyt b基因序列的遺傳

22、距離在10%以上時就具有種的差異的結(jié)果且遠遠高出一般種內(nèi)和亞種間的范圍。,,據(jù)其他一些動物的Cyt b基因序列分析的結(jié)果，種內(nèi)個體間的平均遺傳距離一般在0～4.06％之間，差異超過6%的個體已有明顯的亞種或種的分化。,魚卵之間以及魚卵與沙氏下鱵魚序列之間Kimura雙參數(shù)法計算遺傳距離為0。,魚卵與其它頜針魚目魚類序列間遺傳距離在21.9～26.4％之間,基于Cyt b基因構(gòu)建的魚卵及同源序列NJ系統(tǒng)樹,,且基于Cyt b基因構(gòu)建的NJ

23、分子系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果顯示魚卵與沙氏下鱵魚序列聚為一支，親緣關(guān)系較近，而與其它頜針魚目魚類序列聚為兩支，親緣關(guān)系較遠。,2.魚卵與沙氏下鱵魚及太平洋頜針魚COⅠ基因片段序列比對分析,魚卵與沙氏下鱵魚及太平洋頜針魚COⅠ基因片段序列變異位點圖,,,,在所有566bp COⅠ基因片段序列中，魚卵與沙氏下鱵魚間僅出現(xiàn)了3個核苷酸替代，而魚卵與太平洋頜針魚COⅠ序列間出現(xiàn)了111個堿基替代,,,,基于COⅠ基因片段序列的遺傳距離，NJ分子系統(tǒng)樹、以

24、及核苷酸組成,,,魚卵與沙氏下鱵魚序列片段間遺傳距離在0～0.4%之間，應(yīng)為種內(nèi)水平差異，而與太平洋頜針魚之間為23.1％左右，已遠遠超過了種類水平的差異,,,3.用D-loop片段序列的驗證,,,,魚卵與沙氏下鱵魚D-loop序列片段之間僅出現(xiàn)3個堿基替代,結(jié)論,魚卵與沙氏下鱵魚基于D-loop基因序列的平均遺傳距離,,,,遺傳距離在0～0.7%之間，也為物種內(nèi)水平的遺傳分化。,小結(jié)：魚卵與沙氏下鱵魚Cyt b與COⅠ基因片段序列間

25、的遺傳距離均為種內(nèi)水平的遺傳變異。而與頜針魚科魚類基因片段序列間的遺傳距離。遠遠超過了物種水平差異。且通過Cyt b與COⅠ基因片段序列的NJ分子系統(tǒng)樹結(jié)果顯示，魚卵與沙氏下鱵魚聚為一支，它們之間親緣關(guān)系較近，而與頜針魚科魚類分聚為兩支，它們之間親緣關(guān)系較遠。用D-loop片段序列進行驗證，得到了相同的結(jié)果。遺傳學(xué)結(jié)果顯示魚卵為沙氏下鱵魚卵,總結(jié),,雖然運用掃描電鏡能夠發(fā)現(xiàn)較多的魚卵鑒別特征，但由于到目前為止真正利用掃描電鏡觀察來

26、鑒別魚卵種類的報道較少，可供參考的資料不足。,,目前形態(tài)學(xué)的方法雖然只能將魚卵鑒定到科或?qū)俚乃?，但其還是鑒定魚卵的手段，且在進行遺傳學(xué)鑒定前，也應(yīng)當(dāng)以形態(tài)學(xué)鑒定的初步結(jié)果為前提來選擇魚卵所屬的科或?qū)俚某婶~來進行比對分析。,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA序列數(shù)據(jù)庫也呈幾何級數(shù)增長，越來越多的魚類基因片段序列被測序，今后可運用GenBank中豐富的資源，將PCR產(chǎn)物直接測序技術(shù)直接運用到魚卵與仔稚魚的準(zhǔn)確鑒別中，提高魚卵鑒別的準(zhǔn)確度。

27、我們也注意到，要運用遺傳學(xué)方法，雖然技術(shù)手段已經(jīng)比較成熟，但是我們需要建立龐大的DNA數(shù)據(jù)庫來記錄各種魚類的基因片段序列，這需要花費大量的時間跟財力。目前，盡管國際上對用線粒體DNA條形編碼鑒別物種尚存爭論，但它操作的簡便性和高效性將以我們無法想象的速度加快物種鑒定和進化歷史研究的步伐。DNA條形編碼是生物分類的大勢所趨，已成為生物分類學(xué)中引人注目的新方向（Ward et al., 2005; Schander & Wil