中國藥典2015年版四部 1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

1、1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中國藥典2015年版未曾用于熱原檢査的家兔；或供試品判定為符合規(guī)定，但組內(nèi)升溫達(dá)0.6C的家兔；或3周內(nèi)未曾使用的家兔，均應(yīng)在檢查供試品前7b內(nèi)預(yù)測體溫，進(jìn)行挑選。挑選試驗(yàn)的條件與檢査供試品時(shí)相同，僅不注射藥液，每隔30分鐘測量體溫1次，共測8次，8次體溫均在38.0?39.6C的范圍內(nèi)，且最高與最低體溫相差不超過0.4C的家兔，方可供熱原檢査用。用于熱原檢査后的家兔，如供試品判定為符合規(guī)定，至少應(yīng)休息48小時(shí)方

2、可再供熱原檢査用，其中升溫達(dá)0.6C的家兔應(yīng)休息2周以上。對(duì)用于血液制品、抗毒素和其他同一抗原性供試品檢測的家兔可在5天內(nèi)重復(fù)使用1次。如供試品判定為不符合規(guī)定，則組內(nèi)全部家兔不再使用。試驗(yàn)前的準(zhǔn)備熱原檢査前1?2日，供試用家兔應(yīng)盡可能處于同一溫度的環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)室和飼養(yǎng)室的溫度相差不得大于3T：，且應(yīng)控制在17?25C在試驗(yàn)全部過程中，實(shí)驗(yàn)室溫度變化不得大于3C，應(yīng)防止動(dòng)物騷動(dòng)并避免噪聲干擾。家兔在試驗(yàn)前至少1小時(shí)開始停止給食并置于寬松

3、適宜的裝置中，直至試驗(yàn)完畢。測量家兔體溫應(yīng)使用精密度為0.1C的測溫裝置。測溫探頭或肛溫計(jì)插人肛門的深度和時(shí)間各兔應(yīng)相同，深度一般約6cm時(shí)間不得少于1.5分鐘，每隔30分鐘測量體溫1次，一般測量2次，兩次體溫之差不得超過0.21以此兩次體溫的平均值作為該兔的正常體溫。當(dāng)日使用的家兔，正常體溫應(yīng)在38.0?39.6T；的范圍內(nèi)，且同組各兔間正常體溫之差不得超過l.Ot：。與供試品接觸的試驗(yàn)用器皿應(yīng)無菌、無熱原。去除熱原通常采用干熱滅菌法

4、（2501、30分鐘以上），也可用其他適宜的方法。檢查法取適用的家兔3只，測定其正常體溫后15分鐘以內(nèi)，自耳靜脈緩緩注入規(guī)定劑量并溫?zé)嶂良s38T：的供試品溶液，然后每隔30分鐘按前法測量其體溫1次，共測6次，以6次體溫中最高的一次減去正常體溫，即為該兔體溫的升高溫度（C)。如3只家兔中有1只體溫升高0.6C或高于0.6C，或3只家兔體溫升高的總和達(dá)1.3C或高于1.3C應(yīng)另取5只家兔復(fù)試，檢查方法同上。結(jié)果判斷在初試的3只家兔中，體溫升

5、高均低于0.6C并且3只家兔體溫升高總和低于1.3C或在復(fù)試的5只家兔中，體溫升髙0.6C或髙于0.6C的家兔不超過1只，并且初試、復(fù)試合并8只家兔的體溫升高總和為3.5C或低于3.5C均判定供試品的熱原檢查符合規(guī)定。在初試的3只家兔中，體溫升高0.6C或高于0.6C的家兔超過1只；或在復(fù)試的5只家兔中，體溫升高0.6C或高于0.61的家兔趄過1只；或在初試、復(fù)試合并8只家兔的體溫升髙總和超過3.5C均判定供試品的熱原檢查不符合規(guī)定。當(dāng)

6、家兔升溫為負(fù)值時(shí)，均以0C計(jì)。?154?1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。細(xì)菌內(nèi)毒素檢査包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測時(shí)，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)測定結(jié)果有爭議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠限度試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)。本試驗(yàn)操作過程應(yīng)防止內(nèi)毒素的污染。細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位（EU)表示，1EU與

7、1個(gè)內(nèi)毒素國際單位（IU)相當(dāng)。細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品系自大腸埃希菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度、標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)，干擾試驗(yàn)及檢查法中編號(hào)B和C溶液的制備、凝膠法中鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)、光度測定法中標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系以細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價(jià)，用于干擾試驗(yàn)及檢查法中編號(hào)B和C溶液的制備、凝膠法中鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)、光度測定法中標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水應(yīng)符合

8、滅菌注射用水標(biāo)準(zhǔn)，其內(nèi)毒素含量小于0_015EUml(用于凝膠法）或0.005EUml(用于光度測定法），且對(duì)內(nèi)毒素試驗(yàn)無干擾作用。試驗(yàn)所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。耐熱器皿常用干熱滅菌法（250C、30分鐘以上）去除，也可采用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢査的適宜方法。若使用塑料器具，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無干擾的器具。供試品溶液的制備某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸

9、提制成供試品溶液。必要時(shí)，可調(diào)節(jié)被測溶液(或其稀釋液）的pH值，一般供試品溶液和鱟試劑混合后溶液的pH值在6.0?8.0的范圍內(nèi)為宜，可使用適宜的酸、堿溶液或緩沖液調(diào)節(jié)pH值。酸或堿溶液須用細(xì)菌內(nèi)毒素檢査用水在已去除內(nèi)毒素的容器中配制。緩沖液必須經(jīng)過驗(yàn)證不含內(nèi)毒素和干擾因子。內(nèi)毒素限值的確定藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)一般按以下公式確定：L=KM式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，一般以EUml、EUmg或EUU(活性單位）表示；K

10、為人每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU(kgh)表示，注射劑iC=5EU(kg?h)，放射性藥品注射劑K=2.5EU(kg?h)，鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU(kgh)；M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量，以1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法MVD并且已經(jīng)排除干擾的供試品溶液來制備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。表2凝肢限度試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無供試品溶液2B2入供試品溶液2C2入檢査

11、用水2D無檢查用水2注：A為供試品溶液；B為供試品陽性對(duì)照C為陽性對(duì)照；D為陰性對(duì)照。結(jié)果判斷保溫60分鐘2分鐘后觀察結(jié)果。若陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對(duì)照溶液B的平行管均為陽性，陽性對(duì)照溶液C的平行管均為陽性，試驗(yàn)有效。若溶液A的兩個(gè)平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定。若溶液A的兩個(gè)平行管均為陽性，判定供試品不符合規(guī)定。若溶液A的兩個(gè)平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進(jìn)行復(fù)試。復(fù)試時(shí)溶液A需做4支平行管，若所有平行

12、管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定，否則判定供試品不符合規(guī)定。若供試品的稀釋倍數(shù)小于MVD而溶液A出現(xiàn)不符合規(guī)定時(shí)，需將供試品稀釋至MVD重新實(shí)驗(yàn)，再對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷。(2)凝膠半定量試驗(yàn)本方法系通過確定反應(yīng)終點(diǎn)濃度來量化供試品中內(nèi)毒素的含量。按表3制備溶液A、B、C和D。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。結(jié)果判斷若陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對(duì)照溶液B的平行管均為陽性，系列溶液C的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值在0.5?2A，試驗(yàn)有效

13、。系列溶液A中每一系列的終點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以A，為每個(gè)系列的反應(yīng)終點(diǎn)濃度。如果檢驗(yàn)的是經(jīng)稀釋的供試品，則將終點(diǎn)濃度乘以供試品進(jìn)行半定量試驗(yàn)的初始稀釋倍數(shù)，即得到每一系列內(nèi)毒素濃度c。若每一系列內(nèi)毒素濃度均小于規(guī)定的限值，判定供試品符合規(guī)定。每一系列內(nèi)毒素濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內(nèi)毒素濃度[按公式CE=antilg(Sc2)]。若試驗(yàn)中供試品溶液的所有平行管均為陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于入(如果檢驗(yàn)的是稀釋過的供試品，則記為小于I乘以

14、供試品進(jìn)行半定量試驗(yàn)的初始稀釋倍數(shù)）。若任何系列內(nèi)毒素濃度不小于規(guī)定的限值時(shí)，則判定供試品不符合規(guī)定。當(dāng)供試品溶液的所有平行管均為陽性，可記為內(nèi)，素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以A。中國藥典2015年版表3凝膠半定量試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度被加人內(nèi)毒素的溶液稀釋用液級(jí)経w押倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無供試品溶液檢査用水1—2224—28—2B2A供試品溶液12A2C2A檢查用水檢查用水12X22n240.5A280.25A2

15、D無檢查用水———2注：A為不超過MVD并且通過干擾試驗(yàn)的供試品溶液。從通過干擾試驗(yàn)的稀釋倍數(shù)開始用檢査用水稀釋至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀釋倍數(shù)不得超過MVD。B為2A濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的溶液A(供試品陽性對(duì)照hC為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對(duì)照系列。D為陰性對(duì)照。方法2光度測定法光度測定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法。濁度法系利用檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化而測定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測原理，可分為終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法。終點(diǎn)濁度法

16、是依據(jù)反應(yīng)混合物中的內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)的濁度（吸光度或透光率）之間存在的量化關(guān)系來測定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)濁度法是檢測反應(yīng)混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度或透光率所需要的反應(yīng)時(shí)間，或是檢測濁度增加速度的方法。顯色基質(zhì)法系利用檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少而測定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測原理，分為終點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)顯色法。終點(diǎn)顯色法是依據(jù)反應(yīng)混合物中內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)釋放出的呈色團(tuán)

17、的量之間存在的量化關(guān)系來測定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)顯色法是檢測反應(yīng)混合物的吸光度或透光率達(dá)到某一預(yù)先設(shè)定的檢測值所需要的反應(yīng)時(shí)間，或檢測值增加速度的方法。光度測定試驗(yàn)需在特定的儀器中進(jìn)行，溫度一般為37C1X：。.供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時(shí)間等，參照所用儀器和試劑的有關(guān)說明進(jìn)行。為保證濁度和顯色試驗(yàn)的有效性，應(yīng)預(yù)先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)以及供試品的干擾試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件