腫瘤細(xì)胞增殖動力學(xué)

1、腫瘤細(xì)胞增殖動力學(xué),細(xì)胞生物學(xué)系劉清華bjqinghual@vip.sina.com,What Kind of Disease Is Cancer?,Some Cases,病例1： 男性76歲， 2003年9月3日因干咳、少 痰、消瘦就診。 CT檢查確診肺癌,病例3： 女性43歲，因上腹部時有疼痛伴返酸2 年、加重1個月入院。

2、 胃鏡活檢報告：胃幽門部黏膜內(nèi)低分化 癌。,病例8： 患者男性，34歲。因發(fā)現(xiàn)右鎖骨腫塊3月入院。 檢查右鎖骨外段稍隆起，局部膨大，表面皮 膚無紅腫或靜脈怒張，無疼痛；肩關(guān)節(jié)活動 稍受限。 X光示右鎖骨外段明顯骨質(zhì)破壞及增生。 病理報告為右鎖骨惡性淋巴細(xì)胞瘤。,病例11：

3、女性68歲，陰道不規(guī)則流血4-5個月。 婦科檢查：子宮前位，如妊娠2月大小，可觸及數(shù) 個結(jié)節(jié)，質(zhì)地中等。 超聲檢查提示子宮混合性占位性病變。  CT診斷：宮體癌，右側(cè)卵巢囊腫。  病理診斷：子宮惡性混合性苗勒氏瘤，累及輸尿 管。,腫瘤學(xué),,CELL,Cell junction,Proliferation,Extracellular

4、matrix,Telomere,Signal transduction,Differentiation,Apoptosis,,,,,,,,,,,,,,,2. What We Have Known about the Cell Cycle Control?,,,,,OncogeneAntioncogene CheckpointsCell Division Cycle Gene, cdc genes;,Cyclins C

5、yclin Dependent Kinases, CDKsCyclin Dependent Kinases Inhibitors, CDKIsS phase Promoting Factor, SPFMaturation Promoting Factor, MPF,,蛋白質(zhì)水平,基因水平,,,3. How to Control in a Normal Cell?,Control of G1 phaseContro

6、l of S phaseControl of G2phaseControl of M phase,Control of G1 phase,Proliferation factors Checkpoint （G0／G1 entrance、R Point G1／S）Cyclin-CDK （cyclinD-CDK4／6 、cyclinE-CDK2 ）P105RB CDKI,Contro

7、l of S phase,Checkpoint (DNA synthesis on、off )Cyclin－CDKPCNA,SPF (cyclinA-CDK1) CyclinE-CDK2 作為啟動蛋白，識別autonomously replicating sequence，ARS ，激活復(fù)制起點(diǎn) 可能是origin recognition complex，ORC 的組成部分,Cyclin－CDK,PCNA,細(xì)胞增

8、殖核抗原DNA聚合酶δ的亞基直接參與DNA復(fù)制和修復(fù),Control of M phase,CheckpointMPF（cyclinB-CDK1),Checkpoint,G2／M： DNA復(fù)制沒有完成，激活wee1 -mik1蛋白激酶，細(xì)胞阻滯于G2期。 M中／晚期：檢查微管蛋白的量、微管組織中心功能、紡錘體極性、微管與動粒附著、或附著在動粒上產(chǎn)生的張力。,MPF的活性調(diào)節(jié),,4. What’s Wrong in

9、a Tumor Cell ?,oncogene的過表達(dá)antioncogene 的失活cyclin基因和表達(dá)蛋白的異常cdki基因和表達(dá)蛋白的異常,5. How to Evaluate Cell Proliferation?,Cell Proliferation Kinetics,研究生物體內(nèi)各種細(xì)胞群體在新生、增殖、消亡過程中處于各種狀態(tài)的細(xì)胞數(shù)量、時間參數(shù)和分布位置的技術(shù)手段。,檢測方法,1.

10、細(xì)胞計數(shù) 2. 生長曲線3. 倍增時間4. 生長分?jǐn)?shù),5. 丟失系數(shù)6. 標(biāo)記指數(shù)7. 分裂指數(shù)8. 細(xì)胞周期參數(shù),1. Cell Counting,直接計數(shù)－－臺盼藍(lán)計數(shù)法 比色半定量－－四唑鹽法,四唑鹽法,[3-4,4-二甲基噻唑－2]，5－二苯基四氮唑溴鹽，簡稱MTT ; 線粒體的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物; 比色測定間接反映活細(xì)胞數(shù)量。,細(xì)胞

11、培養(yǎng) 顯色 : 加入MTT溶液(5mg/ml) ，繼續(xù) 培養(yǎng)4h，加DMSO，振蕩10min 比色：490nm波長測定光吸收值,Breast Cancer Research and Treatmeat 2004;84:251-260 6. Their Research Strategy ? 7. The Technology They Used?,2. Growth C

12、urve,Cell culture ; Cell counting：每次至少3瓶，每瓶至少3次，取平均數(shù)；共做7天； 作圖：培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，在對數(shù)坐標(biāo)紙上作圖。,,0.1,,,,,,,,0.1,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,3. Doubling Time,In vivo : DT=0.1 ×t / log Dt – log Do Do :首次

13、測得的腫瘤直徑（cm） Dt :t 時間后測得的直徑（cm）,Computed Tomography,,某轉(zhuǎn)移癌： Do ＝2，Dt＝4，t＝90 DT = 0.1 × 90 / 0.6 - 0.3 = 30(d) effective doubling time, TD eff：考 慮細(xì)胞丟失因素的細(xì)胞倍增時間 potential d

14、oubling time, TD pot：不 考慮細(xì)胞丟失因素的細(xì)胞倍增時間,原發(fā)性肺癌 腺癌 64 21 鱗癌 85 12 間變性癌 55 11乳腺癌

15、 17 14結(jié)－直腸癌 19 90 淋巴瘤 27 4,腫瘤類型,病例數(shù),倍增時間（周）,,,,780例人體腫瘤體積倍增時間 Steel（1977）（未完）,4. Growth Fracti

16、on，GF,腫瘤中增殖細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例GF=P / P+Q P : proliferation Q：quiescent,5. 丟失系數(shù)Φ,丟失系數(shù)Φ＝KL / KB KL：細(xì)胞群體在增殖過程中的丟失率 KB：細(xì)胞群體在增殖過程中的生成率,6. Labeling Index, LI,LI＝Ns / N Ns:

17、 Number s phase,常用方法： 3H-TdR BrdU PCNA 、Ki67,3H-TdR,3H-TdR和細(xì)胞短暫孵育；間隔時間取材；放射自顯影；圖像分析儀計數(shù)或液閃計數(shù)；SPSS 統(tǒng)計分析。,BrdU,BrdU和細(xì)胞共孵育較長

18、時間；取材固定；加入BrdU抗體；加入生物素標(biāo)記的二抗；,加入鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化酶；DAB顯色；圖像分析儀計數(shù)；SPSS 統(tǒng)計分析。,Chinese journal of Cancer 2003;22(11):1127-1134,PCNA,取材固定；加入PCNA抗體；加入生物素標(biāo)記的二抗；加入底物；顯色；圖像分析儀計數(shù)；SPSS 統(tǒng)計分析。,Synovial sarcoma Immunohistoche

19、mical Strong staining of PCNA J. Vet. Sci2004;5(2):173-180,Ki-67,Positive staining for Ki67, Cancer Cytopathl 2004;102:142-9,7. Mitotic Index，MI,經(jīng)典方法免疫熒光方法,經(jīng)典方法,Synovial sarcome. Mitotic

20、figures J. Vet. Sci2004;5(2):173-180J Nippon Med Sch 2003; 70（3）219-226,免疫熒光方法,8.Parameter of Cell Cycle,Tc 、TG1、Ts、TG2和TM； 常用的有3H-TdR標(biāo)記法和流式細(xì)胞 技術(shù) flow cytometry,Flow Cytometry,利用流式細(xì)胞儀flow cytometre，F(xiàn)CM細(xì)胞快速、準(zhǔn)

21、確、多參數(shù)的定量分析體積，DNA含量、蛋白質(zhì)含量、酶活性、細(xì)胞膜受體量、表面抗原量等等,無菌分類收集活細(xì)胞。,,Breast Cancer Research and Treatment 2004;84:251-260,應(yīng)用,腫瘤的周期化、同步化治療LI檢測對化療藥物的敏感性提示療效和預(yù)后癌前病變的檢測 完,Thank you,,癌分子細(xì)胞生物學(xué),癌相關(guān)基因,癌遺傳學(xué),環(huán)