氨基酸的分離紙層析法

1、生物化學實驗,張積森（zjisen@gmail.com),,生物化學(Biochemistry)：研究生命物質的化學組成、結構及生命活動過程中各種化學變化的基礎生命科學.化學生物學（Chemical Biology)：利用化學手段研究生物學問題或利用生物學手段解決化學問題.,,,Introduction,A Multidisciplinary Science,生物化學實驗,介紹生物化學實驗的原理和方法動手! 使用各種生

2、物化學實驗儀器，掌握生物化學的各種基本實驗方法和操作技能加深對生物化學理論知識的認識和理解。,What should we get,設計一個實驗的基本思路，根據(jù)掌握的實驗基本原理，嚴密地組織自己的實驗，合理地安排實驗步驟和時間－－去解決所需要解決的問題。,生化實驗四大 必殺技,離心電泳層析光譜,What should we do,預習：操作：安全&什么是動手能力強？記錄：Raw Data總結：,實驗記錄,實驗前預習

3、，了解要學習的主要內容。實驗中要詳細記錄實驗條件，如使用的儀器型號、編號、生產廠等；生物材料的來源、試劑的規(guī)格、試劑的濃度等。實驗中應及時準確地記錄所觀察到的現(xiàn)象和測量的數(shù)據(jù)。即使觀測的數(shù)據(jù)相同或偏差很大，也都應如實記錄，不得涂改,實驗報告（A4大小紙，計算成績！),實驗目的 實驗原理 儀器、材料和試劑 實驗步驟 結果討論（含數(shù)理據(jù)處） 注意事項,成績,考勤課堂表現(xiàn)實驗報告筆試實際操作考試,實驗一 氨基酸的

4、分離鑒定 ——紙層析法,【實驗目的】,學習氨基酸紙層析法的基本原理掌握氨基酸紙層析的操作技術,紙層析法屬于分配層析，它是以層析濾紙為載體，以吸附于濾紙纖維羥基上的一層水（極性）為固定相，流動相是有機溶劑，主要是正丁醇（非極性溶劑）。分離氨基酸是根據(jù)不同氨基酸的極性，在固定相和流動相中的分配系數(shù)不同而進行分離的（依據(jù)相似相溶原理）。,【實驗原理】,分配層析: 利用混合物中各組分在兩種不同溶劑中的分配系數(shù)不同而

5、使物質分離的方法。分配系數(shù): 是指一種溶質在兩種互不相溶的溶劑中的溶解達到平衡時，該溶質在兩種溶劑中所具有濃度之比。不同的物質因其在各種溶劑中的溶解度不同，因而也就有不同的分配系數(shù)。。,氨基酸被分離后在紙層析圖譜上的位置是用Rf值(比移值)來表示的。 在一定的條件下某種物質的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質的結構、性質、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質量和層析溫度等因素有關。,【實驗器材與試劑】,1、層析缸

6、2、毛細管 3、喉頭噴霧器 4、培養(yǎng)皿 5、層析濾紙6、鉛筆（直尺）7、分液漏斗 8、吹風機,9、 正丁醇10、冰醋酸11、氨基酸標準樣品12、氨基酸混合樣品13、0.1%水合茚三 酮正丁醇溶液,【實驗步驟】,1、配擴展劑： 正丁醇：冰醋酸：水= 20ml ：5ml ：15ml 順序：正丁醇→冰醋酸→水，放入分液漏斗中，充分混勻。靜置約10min后分層，放出下層水層，其余的倒入

7、培養(yǎng)皿中。,2. 準備濾紙 取一張層析濾紙，距紙底邊2cm處用鉛筆劃一橫線，沿線每隔2.5cm作一記號為點樣處，點樣處也不要太靠近兩側邊（約距1.5cm），會產生邊緣效應。 3.點樣（順紙紋方向） 用毛細管依次吸取標準品氨基酸和混合樣，吸管與濾紙垂直，輕輕接觸紙面，樣品擴散直徑小于3mm。一滴滴完后用冷風(低溫）吹干，再點第二次，共點三次。,4.擴展 將點完樣的濾紙兩側面對齊，用針線縫合，紙的兩邊不能接

8、觸。將點樣后的濾紙直立于培養(yǎng)皿的擴展劑中，（點樣的一端在下，擴展劑的液面需低于點樣線1 cm ）當溶劑展層至濾紙上沿2cm處展層結束，取出濾紙。用鉛筆畫出展層前沿位置，在通風櫥中用熱風吹干。,5. 顯色 用喉頭噴霧器均勻噴上0.1％茚三酮正丁醇溶液，然后用熱風吹干即可顯出各層析斑點。,6. 測量、計算： 分別測量X、Y值，計算各氨基酸的Rf值。 Rf= X÷Y,注意事項,1、手盡量小心接觸濾紙，

9、順紙紋方向層析。2、吸取樣品的毛細管不可混用。3、點樣圈不能距離紙邊太近，各點之間的距 離不能太近。4、吹干時一定要保證完全吹干。,5、縫合時，濾紙的兩個紙邊不能相互接觸并且底邊應對齊，點樣線一面濾紙朝外。 6、點樣時，樣品擴散圈不能過大，直徑小于3mm。7、使用移液管時應右手拿管，左手拿吸耳球并用食指堵管口。8、使用移液管時，應先看清管的最大刻度，每一格代表多少后再量取。,9、 15ml水是用蒸餾水，在水槽邊的大

10、玻璃瓶中。10、 實驗結束請清洗實驗玻儀，但不要清洗展層缸及其中的培養(yǎng)皿。11、有機廢液倒入右側實驗臺上的“廢液收集有機溶劑”大試劑瓶中。12、 實驗結束, 回收竹夾子、A4復印紙、電吹風。13、實驗報告要寫同組同學號數(shù)、名字，層析濾紙貼在其中一位同學的實驗報告上。14、坐椅推入實驗臺下，空出過道。,【結果分析與討論】 【思考題】,通過本次實驗，討論下列問題：（1）簡述紙層析的原理。（2）判斷氨基酸極性大小順序，討論A

11、A極性與Rf的關系？（3）什么是Rf值？影響的主要因素是什么？,,展層劑的配制,正丁醇 : 冰醋酸 : 水=20mL : 5mL : 15mL放置分液漏斗中，塞上塞子，充分振蕩，靜置分層。（先混和正丁醇和冰醋酸）棄下層水層。放10mL左右于培養(yǎng)皿中，并置于密閉的層析缸中。,,下次實驗,總氮量的測定－凱氏定氮法（405實驗室）,氨基酸（amino acid）：含有氨基和羧基的一類有機化合物的通稱。生物功能大分子蛋白質的基本組成單位，是

12、構成動物營養(yǎng)所需蛋白質的基本物質。是含有一個堿性氨基和一個酸性羧基的有機化合物。氨基連在α-碳上的為α-氨基酸。組成蛋白質的氨基酸均為α-氨基酸。,必需氨基酸（essential amino acid）： 指人體（或其它脊椎動物）不能合成或合成速度遠不適應機體的需要，必需由食物蛋白供給，這些氨基酸稱為必需氨基酸。成人必需氨基酸的需要量約為蛋白質需要量的20%～37%。共有8種其作用分別是： 　　賴氨酸：促進大腦發(fā)育，是肝及膽的組成成分

13、，能促進脂肪代謝，調節(jié)松果腺、乳腺、黃體及卵巢，防止細胞退化； 　　色氨酸：促進胃液及胰液的產生； 　　苯丙氨酸：參與消除腎及膀胱功能的損耗； 　　蛋氨酸（甲硫氨酸）：參與組成血紅蛋白、組織與血清，有促進脾臟、胰臟及淋巴的功能； 　　蘇氨酸：有轉變某些氨基酸達到平衡的功能； 　　異亮氨酸：參與胸腺、脾臟及腦下腺的調節(jié)以及代謝；腦下腺屬總司令部作用于甲狀腺、性腺； 　　亮氨酸：作用平衡異亮氨酸； 　　纈氨酸：作用于黃體、乳腺