越橘變異株生物學(xué)特性及ISSR分子標(biāo)記研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、越橘(Vaccinium vitis-idaea Linn.),俗稱藍(lán)莓,為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium Linn.)灌木或小喬木。全世界越橘屬植物約有450個種,我國已知有91個種,28個變種,主要分布在我國東北和西南地區(qū)。北美地區(qū)既是越橘原產(chǎn)地也是主要產(chǎn)區(qū)。越橘果實(shí)為藍(lán)色小漿果,富含多種維生素、黃酮、花青素,具有顯著提高視力和抗癌保健功效,近年來世界各地需求量不斷增加。
  南高叢越橘品種V3及Le

2、gacy引種西南地區(qū)多年,V3長勢旺盛,但果實(shí)很?。籐egacy果實(shí)中等,長勢較為旺盛,但在重慶每年春夏梅雨季節(jié),葉片易出現(xiàn)大量褐色病斑,抗病性較差。由于多倍體植株具有器官巨大性、抗性增強(qiáng)及營養(yǎng)成分增加等特點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)室連續(xù)若干年采用秋水仙堿對北高叢、南高叢越橘不同品種進(jìn)行加倍,陸續(xù)得到了不同表型的變異植株。在誘變初期雖已經(jīng)對變異株的形態(tài)學(xué)及細(xì)胞學(xué)進(jìn)行了分析鑒定,但在田間栽培過程中,變異株還陸續(xù)有新的表型特征出現(xiàn)。加倍后的多倍體回復(fù)突變問

3、題一直是研究中的空白領(lǐng)域,植株在回復(fù)突變中的生物學(xué)特性及分子水平的變化等指標(biāo)的記錄是進(jìn)行基礎(chǔ)研究的重要數(shù)據(jù)。因此,本研究運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在DNA水平對變異株進(jìn)行分析,并結(jié)合形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)檢測方法對變異植株與正常植株的解剖結(jié)構(gòu)、生理指標(biāo)、染色體數(shù)目進(jìn)行分析研究和差異顯著性比較,進(jìn)一步確認(rèn)變異株在回復(fù)突變過程中的各方面指標(biāo)的變化,旨在為越橘的多倍體育種提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。
  主要研究結(jié)果如下:
  1.V3變異株移栽田間

4、生長三年后,形態(tài)學(xué)鑒定顯示:平均高度為對照的110%,莖直徑為對照的132%,葉長、葉寬為對照的144%、137%。與對照相比,變異株長勢更好但果實(shí)較小,三棵變異株之間無顯著差異。Legacy經(jīng)秋水仙素誘變后,根據(jù)表型特征分為L1、L2兩種類型。L1變異株表現(xiàn)多倍體的特性,經(jīng)鑒定:莖粗,葉長、葉寬與對照相比分別增加了40%、56%、52%,為顯著差異;L2變異株為分枝量增大類型,移栽田間后株高相比對照下降32.5%,分枝量增加194.4

5、%,為極顯著差異,葉長寬分別增加34%、38%,與對照相比差異顯著。
  2.經(jīng)葉表皮氣孔觀察,氣孔密度方面:V3變異株下降20.5%;L1變異株下降11.6%,與對照相比差異顯著;保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目:V3變異株增加14.6%,L1變異株增加35.6%,L2變異株增加24.6%,與對照相比均為顯著差異。氣孔保衛(wèi)細(xì)胞平均長度、寬度:L1變異株分別增加16.7%、18.4%,與對照差異顯著;V3、L2與對照相比差異不顯著。兩個品種的變

6、異株葉片橫切結(jié)構(gòu)顯示:葉片主脈直徑、上表皮厚度、柵欄組織及海綿組織厚度均顯著增加,Legacy變異株的葉片結(jié)構(gòu)緊密度(CTR)與對照在5%水平上存在差異,柵/海比明顯高于對照,表明Legacy變異株抗旱能力較對照有增強(qiáng)。
  3.去壁低滲火焰干燥法對變異株莖尖染色體鑒定結(jié)果表明:越橘V3及L1變異株均為二倍體細(xì)胞和四倍體細(xì)胞共存的嵌合體,多倍體細(xì)胞比率分別為:45.52%、38.62%,較其誘導(dǎo)初期鑒定結(jié)果(70%、49.06%)

7、相比呈下降趨勢,表明在越橘異倍型嵌合體中,二倍體細(xì)胞分裂增殖速度較四倍體細(xì)胞快,加倍后有回復(fù)突變傾向。
  4.V3變異株的葉綠素含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量均較對照顯著增加,丙二醛含量顯著下降;Legacy變異株的葉綠素含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量均較對照增加,丙二醛含量下降,呈極顯著差異。表明變異株具有生長優(yōu)勢,抗逆性更強(qiáng)。
  5.采用改良CTAB法獲取高質(zhì)量越橘DNA。通過直觀分析和方差分析結(jié)合,建立了越橘ISS

8、R-PCR(20μl)最佳反應(yīng)體系,各組分的濃度為:10×buffer2μl;Taq酶0.75U;Mg2+1.875mmol.L-1;DNA80ng;dNTP0.1mmol.L-1;引物0.2μmol.L-1。在此基礎(chǔ)上探討了引物UBC835的最佳退火溫度、循環(huán)次數(shù)和延伸時間,結(jié)果分別為54.2℃、35次、60s。電泳結(jié)果顯示優(yōu)化體系穩(wěn)定性較高。
  6.對V3、Legacy變異株及在田間栽培中出現(xiàn)表型變異的南高叢品種-南好變異株

9、(B1、B2、B3)及10個由本實(shí)驗(yàn)室長期栽培保存的北高叢和南高叢越橘品種共21個樣品進(jìn)行ISSR多態(tài)性擴(kuò)增。從70個ISSR引物中篩選出10個多態(tài)性高且較穩(wěn)定的引物,共擴(kuò)增出95個位點(diǎn),多態(tài)性位點(diǎn)90個,多態(tài)比率為94.70%。UPGMA聚類顯示21個樣品的遺傳距離介于0.57~0.83,均值0.7,在系數(shù)0.57處材料被分為南北高叢兩大分支。3個品種的變異株均表現(xiàn)出很高的多態(tài)性。與對照株相比,變異株在ISSR-PCR擴(kuò)增中的條帶差異

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