JE疫苗突變株生物學(xué)特性及鴨坦布蘇病毒流行株基因特征研究.pdf

1、日本腦炎病毒（JEV）是人病毒性腦炎的主要病原。JEV可引起嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的傳染病，且病死率較高，JEV同時也是馬致死性腦炎的主要病原，還會導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)弱仔和公豬的睪丸炎以及少數(shù)仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。JEV是一種自然疫源性病原，自然界中大部分脊椎動物都是其易感宿主，并主要在蚊子和豬之間傳播，其中三帶喙庫蚊是其主要的傳播媒介，豬是其主要的貯存和增殖宿主，鳥類也可參與其擴增功能并在環(huán)境中參與病毒的長距離傳播。JEV是一種單股

2、正鏈的RNA病毒，是黃病毒屬JE血清群的原型病毒，其基因組編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白。在病毒蛋白翻譯過程中，JEV NS2A基因上的七聯(lián)滑動體和下游的假結(jié)體結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致核糖體讀碼框的-1位移碼，進(jìn)而產(chǎn)生一個NS1衍生蛋白，NS1'蛋白。初步研究表明NS1'蛋白可能與病毒的神經(jīng)嗜性有關(guān)。本研究利用反向遺傳技術(shù)驗證了NS2A基因的第66位核苷酸是JEV表達(dá)NS1'蛋白的關(guān)鍵位點之一，同時闡明了NS1'蛋白不能顯著增強JE疫苗弱毒株的神經(jīng)

3、毒力，論證了分泌型NS1'蛋白可以作為檢測野毒感染的生物標(biāo)記。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)NS1'蛋白能夠抑制宿主的IFN-β信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　主要研究內(nèi)容為以下四個部分:
　　1.日本腦炎病毒E279對病毒蝕斑形態(tài)和神經(jīng)毒力的作用研究
　　乙型腦炎是一種由日本腦炎病毒引起的，廣泛流行于亞洲各個地區(qū)的病毒性腦炎。目前還沒有特異性針對乙型腦炎的治療藥物，主動免疫是在人群和易感動物中預(yù)防JEV感染的最有效的方法。本研究對商品化的

4、豬乙型腦炎和人乙型腦炎疫苗弱毒株進(jìn)行評估。結(jié)果顯示所有商品化疫苗均達(dá)到生產(chǎn)要求，JEV RNA拷貝數(shù)和病毒滴度均大于105每頭份。但是蝕斑形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)四株疫苗的蝕斑大小存在明顯差異，兩株豬乙型腦炎疫苗弱毒株在BHK-21細(xì)胞上蝕斑形態(tài)明顯偏小。全基因序列分析顯示突變主要發(fā)生在5'非編碼區(qū)扣E基因，并檢測到了幾個顯性突變位點，而兩株豬用疫苗弱毒株僅在基因組1813位有一個共同的顯性突變。全基因測序峰圖分析發(fā)現(xiàn)幾個核苷酸位點存在特異性的套峰

5、，說明所檢測的病毒在這些位點存在核苷酸的不完全置換。對兩株豬用疫苗株的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在E蛋白的鉸鏈區(qū)發(fā)生了關(guān)鍵位點的突變。通過對疫苗株進(jìn)行蝕斑純化，全基因分析以及疫苗回歸實驗，闡明了JEV的E279由原來的蛋氨酸突變?yōu)橘嚢彼峥梢詫?dǎo)致病毒在BHK-21細(xì)胞上蝕斑形態(tài)的變小，論證了在BHK-21細(xì)胞上能夠顯著增加子代病毒的含量。乳鼠攻毒實驗表明該位點的突變能夠顯著增強疫苗株對兩周齡乳鼠的神經(jīng)毒力。本研究發(fā)現(xiàn)JE疫苗株在病毒傳代

6、過程中容易發(fā)生關(guān)鍵位點的突變，為疫苗的安全生產(chǎn)和評估提供了有價值的信息。
　　2.JEV NS1'蛋白在疫苗弱毒株的產(chǎn)生機制及其在病毒感染中的作用研究
　　本研究首先建立了JEV弱毒株SA14-14-2的反向遺傳體系，并利用反向遺傳技術(shù)驗證了JE血清群病毒表達(dá)NS1'蛋白的分子機制。NS1'蛋白是NS1蛋白在C端延伸52個氨基酸的衍生蛋白，是由于病毒在翻譯過程中發(fā)生讀碼框的-1位移碼引起的。JE疫苗弱毒株由于基因突變而廢除N

7、S1'蛋白的表達(dá)。本文通過回復(fù)突變NS2A基因的A66G可以恢復(fù)病毒NS2A基因的假結(jié)體二級結(jié)構(gòu)，促成了讀碼框-1位移碼的發(fā)生，并導(dǎo)致NS1'蛋白的表達(dá)。但是NS1'蛋白在BHK-21細(xì)胞上對病毒的復(fù)制效率幾乎不產(chǎn)生影響，動物實驗表明NS1'蛋白不能顯著增強JEV弱毒株SA14-14-2的神經(jīng)毒力。然而，相對于不表達(dá)NS1'蛋白的病毒(rSA14-14-2)，表達(dá)NS1'蛋白的病毒(rA66G)能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生更高的獲得性免疫應(yīng)答。此外

8、，NS1'蛋白可以從病毒感染細(xì)胞中分泌出來，在受感染動物的血漿中和受感染細(xì)胞培養(yǎng)的上清中均能檢測到分泌型NS1，蛋白，且NS1'蛋白只以二聚體的形式分泌到受感染細(xì)胞外。通過半定量分析發(fā)現(xiàn)，分泌到細(xì)胞外NS1'蛋白的數(shù)量與分泌的病毒粒子呈正相關(guān)性。雖然NS1'蛋白與病毒的毒力沒有明顯相關(guān)性，但是相比較JE疫苗弱毒株不表達(dá)NS1'蛋白，大部分的流行毒株可以表達(dá)NS1'蛋白。因此，分泌型NS1'蛋白可以代替病毒血癥作為生物標(biāo)記區(qū)分野毒感染和疫

9、苗接種。
　　3.體外模擬核糖體移碼機制及NS1，蛋白的亞細(xì)胞分布特征
　　NS1'蛋白是NS1蛋白在C端延伸52個氨基酸的衍生蛋白，是由病毒在翻譯過程中發(fā)生讀碼框的-1位移碼引起的。本研究通過體外模擬JE血清群病毒核糖體-1位移碼機制構(gòu)建了NS1'蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒。并應(yīng)用真核質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染12h后，就能檢測到NS1'蛋白的表達(dá)。在轉(zhuǎn)染的早期，NS1'蛋白的表達(dá)存在時間依賴關(guān)系。真核表達(dá)的NS1'蛋白也

10、具有跨膜分泌的特性，也能夠形成二聚體的表現(xiàn)形式。對于真核表達(dá)的NS1'蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)NS1'蛋白均勻分布于BHK-21細(xì)胞的胞漿中，與NS1蛋白在BHK-21細(xì)胞內(nèi)的分布沒有明顯的差異。
　　4.JEV NS1'蛋白對宿主IFN-β信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響
　　本研究通過雙報告基因系統(tǒng)分析JEV NS1'蛋白對IFN-β啟動子活性的影響。首先，構(gòu)建了五個IFN-β啟動子活性域測試質(zhì)粒，并在PK15細(xì)胞上檢測其基礎(chǔ)活性和對

11、POLY(I∶C)刺激的反應(yīng)性。測試結(jié)果顯示，缺失IFN-β啟動子活性域Ⅰ/Ⅲ和Ⅱ的兩個測試質(zhì)粒是失活性缺失，其幾乎不存在基礎(chǔ)活性，對POLY(I∶C)刺激的反應(yīng)性較低。而未缺失IFN-β啟動子活性域或缺失活性域Ⅳ，以及串聯(lián)4個活性域Ⅰ/Ⅲ的測試質(zhì)粒均有較高的基礎(chǔ)活性，且對POLY(I∶C)刺激具有良好的反應(yīng)性。通過與測試質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NS1'蛋白能夠抑制POLY(I∶C)刺激后IFN-β啟動子活性。并對其基礎(chǔ)活性也能產(chǎn)

12、生一定的抑制作用。此外，NS1'蛋白幾乎不能抑制真核表達(dá)的IRF7刺激后IFN-β啟動子活性。通過間接免疫熒光實驗證明了NS1'蛋白在PK-15細(xì)胞上能夠有效抑制POLY(I∶C)刺激后NF-κB的入核作用。通過病毒感染模型，闡明了在干擾素應(yīng)答的宿主細(xì)胞內(nèi)，NS1'蛋白能夠有效增加JEV的mRNA水平，并在感染早期抑制IFN-β的mRNA水平。通過免疫共沉淀和質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)在干擾素應(yīng)答的宿主細(xì)胞內(nèi)，NS1'蛋白可能與熱應(yīng)急蛋白、Vimen

13、tin和TRIM21發(fā)生相互作用，進(jìn)而抑制宿主的先天性免疫反應(yīng)。
　　5.鴨坦布蘇病毒流行株的全基因特征研究
　　鴨坦布蘇病毒(DTMUV)是一種可引起鴨產(chǎn)蛋量下降、采食量銳減，并導(dǎo)致部分感染鴨死亡的蚊蟲傳播的黃病毒。2011年，對我國安徽地區(qū)鴨坦布蘇病毒進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，從感染鴨群中分離出一株鴨坦布蘇病毒(DTMUV-AH2011)。通過序列測定和全基因分析顯示，DTMUV-AH2011分離株全基因為11，064nt，含有

14、一個10，278nt的開放式閱讀框，在開放式閱讀框的5'端有94nt的5'NTR，開放式閱讀框的3'端有692nt的3'NTR。與其他5株坦布蘇病毒全基因相比，DTMUV-AH2011分離株的3'NTR有74nt的插入序列。通過對病毒編碼蛋白氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，近年來國內(nèi)分離的所有坦布蘇病毒均含有相對保守的多聚蛋白前體，氨基酸同源性在98.9％以上。除了NS4B蛋白沒有氨基酸置換外，其余蛋白均有氨基酸的隨機置換。對鴨坦布蘇病毒的生物學(xué)特