黃瓜花葉病毒生物學(xué)特性及分子變異研究.pdf

1、目的:
　　CMV是植物寄主最廣泛的植物病毒,嚴(yán)重影響新疆農(nóng)作物的生產(chǎn)。本文以新疆伊寧和石河子地區(qū)采集的加工番茄為主的幾種蔬菜為實(shí)驗(yàn)材料,從血清學(xué)水平、分子水平上闡述CMV在新疆的侵染率、株系分化、重組等分子變異,并從分子水平闡述其衛(wèi)星RNA的分子變異。同時(shí)對(duì)部分樣品進(jìn)行CMV的分離純化,然后對(duì)它的生物學(xué)特性及分子變異進(jìn)行研究。最終從生物學(xué)、基因組水平上系統(tǒng)闡述新疆地區(qū)CMV的株系分化、重組等分子變異,為今后新疆地區(qū)培育抗CMV植

2、株提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　本研究從石河子蔬菜研究所采集南瓜和加工番茄樣品中提取dsRNA,以dsRNA為模板利用RT-PCR方法擴(kuò)增CMV衛(wèi)星RNA序列和CMV RNA3序列;從新疆石河子和伊寧地區(qū)采集了加工番茄、辣椒、番茄、南瓜樣品,用CMV亞組I型抗體DAS-ELISA和CMV亞組Ⅱ型抗體DAS-ELISA檢測(cè);在昆諾藜上單斑分離純化CMV,并接種植物觀察其生物學(xué)特性;以RNA為模板采用One-step RT-P

3、CR技術(shù)擴(kuò)增辣椒等17個(gè)樣品的RNA3相關(guān)序列,采用兩步法RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增各分離物的全基因組相關(guān)序列。
　　結(jié)果:
　　克隆自石河子蔬菜研究所的南瓜樣品衛(wèi)星RNAN-sate及加工番茄樣品的衛(wèi)星RNATo-10-sate、S9、S18-1和S18-2的片段大小分別為:335nt、381nt、334nt、396nt和334nt。比對(duì)發(fā)現(xiàn)5者都不含有引起黃化癥狀的衛(wèi)星RNA株系CMVYSAT所具有的黃化區(qū)域,且都與國(guó)內(nèi)的分離

4、物相似性較高。
　　伊寧、石河子蔬菜研究所樣品的血清型CMV亞組?型抗體檢出率分別為:加工番茄74.15％(152/205)、辣椒8.6%(2/23)、番茄75%(3/4)、南瓜100%(2/2);CMV亞組Ⅱ型抗體均呈陰性。
　　擴(kuò)增獲得南瓜樣品N、YN-8、YN-9,番茄樣品YN-2,加工番茄樣品To-10和S1-14的RNA3全序列及辣椒樣品YN-6、LJ-4、LJ-10和加工番茄樣品S1-1、S1-3、S1-4、S1

5、-18、S1-27、S2-76、S2-81、S3-13、S3-47、S3-59的CP全長(zhǎng)及MP部分序列,序列分析發(fā)現(xiàn)獲得的19個(gè)序列都與CMV亞組?B親緣關(guān)系較近,同時(shí)發(fā)現(xiàn)從辣椒樣品獲得的LJ-4和LJ-10與其他樣品的CP序列相比相似性較低,表現(xiàn)出較高的變異,并且與?X的親緣關(guān)系最近。
　　通過(guò)RT-PCR技術(shù)獲得石河子農(nóng)市場(chǎng)加工番茄分離物NS0-4和石河子蔬菜研究所辣椒分離物L(fēng)J-12的基因組RNA1、RNA2、RNA3全長(zhǎng)序

6、列,石河子蔬菜研究所加工番茄分離物S2-58的基因組RNA1、RNA2全長(zhǎng)序列和RNA3的部分序列以及農(nóng)市場(chǎng)米豆分離物M的RNA1全長(zhǎng)和RNA2、RNA3的部分序列。全基因組序列分析結(jié)果顯示:LJ-12分離物基因組序列變異較大,與來(lái)自同地區(qū)的分離物S2-58都存在亞組內(nèi)重組現(xiàn)象,而來(lái)自另一地區(qū)的NS0-4和M基因組卻不存在重組現(xiàn)象。
　　癥狀觀察結(jié)果顯示:NS0-4侵染心葉煙、番茄后出現(xiàn)厥葉癥狀,心葉煙葉片變脆,番茄植株矮化等癥狀

7、,而且出現(xiàn)癥狀較晚;S2-58侵染心葉煙后植株出現(xiàn)葉柄不生長(zhǎng)、葉片深綠且呈團(tuán)座狀、葉脆等癥狀,侵染本氏煙后植株出現(xiàn)葉片深綠、白化斑、輕微皺縮狀等癥狀;M侵染心葉煙后出現(xiàn)黃化、葉片皺縮卷曲、泡突、葉柄變長(zhǎng)等癥狀,侵染本氏煙后植株上顯示葉片翠綠色、泡突、皺縮、分支多等癥狀。
　　結(jié)論與推測(cè):
　　對(duì)所有研究結(jié)果的分析表明:在新疆加工番茄及其它蔬菜上廣泛流行的CMV為CMV亞組IB,且存在重組、株系分化等分子變異現(xiàn)象,尤其是侵染辣

8、椒植株的CMV;CMV及其衛(wèi)星RNA的序列多態(tài)性與地域有一定的相關(guān)性,但是與寄主類別無(wú)關(guān);獲得的五個(gè)衛(wèi)星RNA序列都不含有CMVYSAT所具有的黃化區(qū)域;對(duì)于新疆辣椒中CMV的檢測(cè)應(yīng)把血清學(xué)檢測(cè)和RT-PCR檢測(cè)2種方法相結(jié)合。
　　根據(jù)結(jié)果推測(cè):NS0-4MP序列192-501堿基之間309個(gè)堿基的缺失不會(huì)使CMV完全失去活性,只是在一定程度上影響了CMV的移動(dòng);侵染辣椒的CMV發(fā)生的這種變異和重組現(xiàn)象,是CMV完成辣椒與其他植