擬除蟲菊酯降解基因的克隆.pdf

1、不動桿菌(Acinetobacter sp.)JXCC2D菌株是由本實驗室篩選所得,對菊酯類等化學(xué)農(nóng)藥具廣譜、高效的降解作用.本研究以該菌株為原始材料,以pGEM-3Z為載體、E.coliJM110為受體菌,通過同尾內(nèi)切酶Mobl和BamHI酶切,成功構(gòu)建了JXCC2D菌株的基因組質(zhì)粒文庫,文庫的庫容約為10<,4>、插入片段長度約為2～7kb. 利用農(nóng)藥-Burk培養(yǎng)基和酯酶篩選培養(yǎng)基對所構(gòu)建的基因組質(zhì)粒文庫進行篩選,選取在農(nóng)藥平板中

2、生長、在酯酶篩選平板上形成透明圈的重組菌株.對篩選得到的重組菌株2-4-38進行了酯酶比活力測定和農(nóng)藥降解能力檢測,實驗結(jié)果表明:該重組菌株具酯酶活性,其比活力為0.535,并為胞外分泌型酶.該重組菌株作用高效氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯108 h后,降解率分別為66.0﹪、50.5﹪、95.7﹪:作用丙溴磷和噠螨靈72h后,降解率分別為32.5﹪和25.996. 對2-4-38重組菌株中插入的大小約為3.2 kb的外源片

3、段進行亞克隆,并對亞克隆片段進行核苷酸序列測定、拼接,得到長為1854bp,具完整閱讀框架,編碼617個氨基酸的基因序列.該序列與假單胞菌MIS38(Pseudomonas sp.)的lipase具有94﹪的相似性.以原始菌株JXCC2D為模板,根據(jù)文庫實驗中獲得的lipase基因序列設(shè)計引物,經(jīng)PCR可擴增出完整的lipase基因序列,整個實驗結(jié)果表明本研究已獲得來源于不動桿菌(Acinetobacter sp.)JXCC2D、具有農(nóng)