淀粉酶活性測定實驗報告

1、班級：植物 092 ：徐煒佳 學號：0901080223淀粉酶活性的測定一、爭論背景及目的 一、爭論背景及目的酶是高效催化有機體陳代謝各步反響的活性蛋白，幾乎全部的生化反響都離不開酶 的催化，所以酶在生物體內(nèi)扮演著極其重要的角色，因此對酶的爭論有著格外重要的意義。酶的活力是酶的重要參數(shù)，反映的是酶的催化力量，因此測定酶活力是爭論酶的根底。酶活 力由酶活力單位表征，通過計算適宜條件下肯定時間內(nèi)肯定量的酶催化生成產(chǎn)物的量得到淀粉酶是水解淀

2、粉的糖苷鍵的一類酶的總稱，依據(jù)其水解淀粉的作用方式，可分為 α- 淀粉酶和β-淀粉酶等。α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的兩種，存在于禾谷類的種子中。β-淀粉酶存在于休眠的種子中，而α-淀粉酶是在種子萌發(fā)過程中形成的。α-淀粉酶活性是衡量小麥穗發(fā)芽的一個生理指標,α-淀粉酶活性低的品種抗穗發(fā)芽,反之則易穗發(fā)芽。目前,關于 α-淀粉酶活性的測定方法很多種,活力單位的定義也各不一樣,國內(nèi)外測定 α-淀粉酶活性的方法常用的有凝膠集中法、3

3、,5-二硝基水楊酸比色法和降落值法 。這 3 種方法所用的材料分別是穎種子、萌動種子和面粉,獲得的 α-淀粉酶活性應當分別是延遲(內(nèi)源)α-淀粉酶、萌動種子 α-淀粉酶和后熟面粉的α-淀粉酶活性。DNS測定方法 優(yōu)點靈敏、準確、準確度高,適宜準確測量小樣品 α-淀粉酶活性大小缺點測定步驟較繁 ,不便分析大量樣品,測定范圍較窄凝膠集中法降落值法簡便、快速、省時、省力,消耗材料和藥品較少 ,不需要特別儀器,測定范圍較寬快速、省時、重現(xiàn)性好、

4、平行性好、消耗的藥品少,適宜于測量大量樣品邊界不清楚,靈敏度與準確度較低,不適宜準確測量 α-淀粉酶活性的大小消耗的材料多,間接測定 α-淀粉酶活性大小本試驗的目的在于把握α-淀粉酶和β-淀粉酶的提取和測定方法。二、試驗原理 二、試驗原理萌發(fā)的種子中存在兩種淀粉酶，分別是α -淀粉酶和β-淀粉酶，β-淀粉酶不耐熱，在高溫下易鈍化，而α-下則發(fā)生鈍化。本試驗的設計利用β-淀粉酶不耐熱的特性，在高溫下〔70℃〕下處理使得β-淀粉酶鈍化而測定

5、α-淀粉酶的酶活性。酶活性的測定是通過測定肯定量的酶在肯定時間內(nèi)催化得到的麥芽糖的量來實現(xiàn)的， 淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，可用 3,5-二硝基水楊酸試劑測定，由于麥芽糖能將后者復原生成硝基氨基水楊酸的顯色基團，將其顏色的深淺與糖的含量成正比，故可求出麥芽糖的含 量。常用單位時間內(nèi)生成麥芽糖的毫克數(shù)表示淀粉酶活性的大小。然后利用同樣的原理測得 兩種淀粉酶的總活性。試驗中為了消退非酶促反響引起的麥芽糖的生成帶來的誤差，每組實 驗都做了相應

6、的比照試驗，在最終計算酶的活性時以測量組的值減去比照組的值加以校正。在試驗中要嚴格掌握溫度準時間，以減小誤差。并且在酶的作用過程中，四支測定管及空白管不要混淆。麥芽糖標準液 0濃度 mg/ml OD520 工程 α(測) α(測) α(對) α(對) α + β α + β α + β α + β(測) (測) (對) (對)OD520平行組數(shù)據(jù)均值 OD520 樣品麥芽糖濃度 mg/ml? ?入 1ml 稀釋后的酶液及 pH5.6 檸

7、檬酸緩沖液 1ml，以下步驟重復α-淀粉酶測定的第④及第⑤的操作。4. 麥芽糖的測定⑴標準曲線的制作取 15ml 具塞試管 7 支，編號，分別參加麥芽糖標準液〔1mg/ml)0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 毫升，用蒸餾水補充至1.0ml，搖勻后再參加 3，5-二硝基水楊酸 1ml，搖勻，沸水浴中準確保溫 5min，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至 15ml，搖勻后用分光光度計于520nm 波長下比色，記錄消光值，以消光值為縱

8、坐標，以麥芽糖含量為橫坐標繪制標準曲線。⑵樣品的測定取 15ml 具塞試管 8 支，編號，分別參加步驟 2 和 3 中各管的溶液各 1ml，再參加 3， 5-二硝基水楊酸 1ml，搖勻，沸水浴中準確煮沸 5min，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至 15ml， 搖勻后用分光光度計于 520nm 波長下比色，記錄消光值，依據(jù)標準曲線進展結果計算。五、數(shù)據(jù)整理及計算 五、數(shù)據(jù)整理及計算上表中前 4 行數(shù)據(jù)為試驗的原始數(shù)據(jù)。以表中前兩行數(shù)據(jù)繪制標準曲線

9、〔見下頁〕，計算上表中第 4 行數(shù)據(jù)〔各樣品的OD 值〕均值，填入上第5 行中，依據(jù)標準曲線的方程，計算第 5 行 OD 值所對應的麥芽糖濃度，填入最終一行，如上表。依據(jù)以上的數(shù)據(jù)整理的結果，結合以下公式計算兩種淀粉酶的活性：〔A－A”〕 ? 樣品稀釋總體積 ? ? 淀粉酶活性〔毫克麥芽糖· 克 ?1鮮重· 分鐘?1〕 ?樣品重〔g〕 ? 5〔B－B”〕 ? 樣品稀釋總體( ? ? ?)淀粉酶活性〔毫克麥芽糖? 克