牦牛腦AQP9的功能特征.pdf

1、缺氧是許多重大疾病尤其是腦疾病發(fā)生發(fā)展的主要誘因。近年來，青藏高原動物對其極端低氧生境適應的生理和遺傳機制已受到廣大學者的高度關注。牦牛是對青藏高原高寒、低氧、枯草期等極端生境適應的唯一大型哺乳動物（海拔4,000m以上）。水通道蛋白9（AQP9）作為“神經元通道”，其不僅參與腦細胞水和能量底物（甘油、尿素、腺嘌呤、尿嘧啶、乳酸和β-羥基丁酸）的轉運，且還參與p53調控相關的細胞凋亡和能量代謝。但到目前為止，尚未見到任何有關牦牛腦AQP

2、9適應低氧功能特征的研究報道。因此，為了探究青藏高原動物對其極端低氧生境適應的分子機制，本論文以牦牛腦作為研究對象，AQP9的結構、表達及其功能特征為突破口，運用基因克隆、載體構建、細胞培養(yǎng)、基因過表達、原位雜交、RT-PCR、免疫組化、免疫熒光及Westernblotting等技術，系統(tǒng)分析了牦牛腦AQP9對其極端低氧生境適應的功能特征。
　　結果：
　　1.基因克隆和生物信息學分析結果表明，牦牛腦AQP9CDS全長氨基酸

3、序列與黃牛、藏羚羊、小鼠及人的同源性分別是89.49％、86.10%、74.92%及65.08%；其中除了與上述物種相比均缺失29個氨基酸的差異外，與同源性最高的黃牛相比僅有2個氨基酸的差異，即在牦牛的第9位為酸性氨基酸谷氨酸，而黃牛、藏羚羊及小鼠的均為堿性氨基酸賴氨酸；重要的是，牦牛的第273位與藏羚羊的相同均為高疏水性的亮氨酸，而低海拔物種黃牛、小鼠及人的均為低疏水性的脯氨酸；牦牛腦AQP9第191-220位缺失的29個氨基酸片段主

4、要集中在第五次跨膜與第三段胞外區(qū)域；且牦牛該蛋白具有較高折疊的二維結構及差異化的三維構象。
　　2.原位雜交定位分析結果表明，在牦牛大腦皮質中，AQP9mRNA的陽性反應產物在其分子層、外顆粒層、外錐體細胞層、內錐體細胞層、內顆粒層及多形層中均有分布，但分子層和顆粒層的著色最深，而多形層的著色最淺，該分布特征與黃牛的基本相似，但總體上牦牛的著色較黃牛的淺；在牦牛大腦海馬中，該陽性產物在海馬皮質和齒狀回顆粒層中均有分布，但齒狀回顆粒

5、細胞的著色最深，該分布特征與黃牛的也基本相似，同樣牦牛的著色也較黃牛的淺。Westernblotting結果表明，牦牛大腦皮質和海馬AQP9蛋白的表達均低于黃牛的（P皮質＜0.05；P海馬＞0.05）。
　　3.功能試驗分析表明：（1）與轉染小鼠和人的相比，轉染牦牛PEGFP-AQP9質粒的N2a細胞其綠色熒光的表達最低；（2）與轉染小鼠和人的相比，轉染牦牛PEGFP-AQP9質粒的大鼠原代培養(yǎng)神經元的胞體較小、軸突與樹突的生長明

6、顯被抑制，而大多數(shù)神經元間未形成正常連接，且更明顯地促進了大鼠原代培養(yǎng)神經元的凋亡，尤其在低氧脅迫下；（3）在常氧狀態(tài)下，與轉染小鼠和人的相比，轉染牦牛的CAGTAG-AQP9質粒較更能促進N2a細胞的凋亡，然而，在低氧狀態(tài)下，轉染牦牛的CAGTAG-AQP9質粒則較小鼠和人的更能抑制N2a細胞的凋亡；（4）在常氧狀態(tài)下，牦牛、小鼠及人AQP9的過表達下調Caspase-3，c-fos的蛋白表達，而上調Bax、Bcl-2和p53的蛋白表

7、達，然而，在低氧狀態(tài)下，牦牛、小鼠及人AQP9的過表達則上調Caspase-3、Bcl-2及c-fos的蛋白表達，而下調Bax和p53的蛋白表達，但不論在常氧還是低氧狀態(tài)下，牦牛的影響趨勢均最小。
　　結論：
　　1.在高原低氧適應中，牦牛腦AQP9獨特的結構特征如牦牛和藏羚羊AQP9第273位均為亮氨酸，而黃牛、人和小鼠的均為脯氨酸；牦牛該蛋白的第191-220位缺失29個氨基酸的片段；二級結構較高的折疊及三維差異化的構象

8、是該高原物種腦細胞對其低氧生境適應的重要機制。
　　2.在高原低氧適應中，牦牛腦AQP9的低表達特征（牦牛腦AQP9mRNA和蛋白的表達水平均低于低海拔物種黃牛的；且牦牛該蛋白真核表達質粒轉染的模式細胞系也具有其低表達特征）也是該高原物種腦細胞對其低氧生境適應的重要機制之一。
　　3.在高原低氧適應中，牦牛腦AQP9可能是通過自身的低表達直接或間接參與p53、Bcl-2/Bax值、c-fos及caspase-3等調控抵抗低氧