基于P38MAPK信號通路探討祛痰活血顆粒含藥血清調(diào)節(jié)NAFLD大鼠原代肝細胞AQP9表達的作用機制.pdf

1、目的：通過觀察祛痰活血顆粒含藥血清對非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠原代肝細胞AQP9的表達及P38MAPK信號通路的影響，進一步從細胞分子層面探討祛痰活血顆粒調(diào)節(jié)AQP9表達的作用機制。
　　方法：⑴20只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為空白血清組和含藥血清組，空白血清組予以生理鹽水(2ml/d)灌胃，含藥血清組予以祛痰活血顆粒(2g/d)灌胃，早晚各一次，連續(xù)3天，末次灌胃1h后，腹主動脈采血制備血清。⑵20只雄性SD大

2、鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常組和模型組，正常組飼以普通飼料，模型組飼以高脂飼料，連續(xù)飼養(yǎng)10周后，HE染色及油紅O染色觀察肝組織病理變化。⑶造模成功后，采用改良的在體原位兩步灌注消化法分離正常大鼠肝細胞和NAFLD大鼠肝細胞，Typan blue染色鑒定細胞活性，倒置相差顯微鏡和CK-18免疫熒光鑒定細胞的形態(tài)和性質(zhì)。⑷將正常大鼠肝細胞作為正常組，NAFLD大鼠肝細胞分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和抑制劑組，培養(yǎng)48h后，

3、正常組及模型組予以10％空白血清，低劑量組予以7.5％空白血清+2.5％含藥血清，中劑量組予以5％空白血清+5％含藥血清，高劑量組予10％含藥血清，抑制劑組予以10％空白血清+1uM P38MAPK抑制劑(SB203580)繼續(xù)培養(yǎng)24h。Realtime-PCR檢測各組肝細胞AQP9mRNA和P38MAPK mRNA的表達水平。Western-blot檢測各組肝細胞AQP9、P38MAPK和P-P38MAPK蛋白的表達水平。
　

4、　結(jié)果：①HE染色:正常組肝細胞排列整齊，細胞內(nèi)未見脂肪空泡。模型組肝細胞排列不齊，細胞內(nèi)可見彌漫性的脂肪空泡，呈“氣球樣”改變。油紅O染色:正常組肝細胞僅見少許散在紅色脂滴;模型組肝細胞內(nèi)可見彌漫性大小不等的紅色脂滴，細胞脂肪變性明顯。②NAFLD大鼠可獲得肝細胞約(1-1.5)×108個/只，細胞存活率＞92％，細胞純度＞98％。細胞接種6h后貼壁，24h后呈島嶼狀連接，48h后相互連接融合成板片狀，細胞呈單核、雙核或多核狀態(tài)。CK

5、-18免疫熒光鑒定陽性。③與正常組相比，模型組AQP9mRNA及蛋白的表達明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，中、高劑量組及抑制劑組AQP9 mRNA及蛋白表達降低，其中抑制劑組降低最為顯著（P＜0.05），而低劑量組與模型組表達無顯著差異(P＞0.05)。④與正常組相比，模型組P38MAPK mRNA的表達及蛋白磷酸化水平顯著升高（P＜0.05）;與模型組相比，低、中、高劑量組及抑制劑組P38MAPK mRNA的表達及蛋白磷酸化水

6、平均有不同程度的降低，其中以中劑量組與抑制劑組降低最為顯著（P＜0.05），而中劑量組與抑制劑組表達無顯著差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：⑴采用改良的在體原位兩步灌注消化法能成功獲得大量高活性、高純度的NAFLD原代肝細胞。⑵NAFLD大鼠肝細胞中AQP9和P38MAPK的表達均顯著高于正常大鼠肝細胞，表明AQP9的和P38MAPK信號通路可能是NAFLD的作用機制之一。⑶P38MAPK抑制劑可抑制NAFLD大鼠肝細胞中P38M