AQP9過表達對肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及分子機制的研究.pdf

1、目的：研究水通道蛋白9（Aquaporin9,AQP9）過表達對肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其分子機制研究。
　　方法：（第一部分）實時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測正常肝細胞株L02和肝癌細胞株SMMC-7721、HepG2、Hep3B及Huh-7中AQP9表達水平，并篩選出SMMC-7721作為后續(xù)實驗肝癌細胞株。將重組慢病毒LV-AQP9-GFP（以空載體LV-GFP作為陰性對照）導入SMMC-7721細胞中，構(gòu)建AQP9過

2、表達SMMC-7721/LV-AQP9重組細胞模型。激光共聚焦顯微鏡下觀察重組慢病毒LV-AQP9-GFP在SMMC-7721細胞中的轉(zhuǎn)染效率，蛋白質(zhì)印跡法檢測AQP9在SMMC-7721/LV-AQP9重組細胞模型中過表達水平。細胞腫脹實驗檢測AQP9過表達細胞模型中AQP9作為水通道功能活化程度。采用劃痕實驗、Transwell侵襲實驗檢驗AQP9過表達對SMMC-7721細胞遷移、侵襲的影響。
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3、 AQP9過表達重組肝癌SMMC-7721/LV-AQP9細胞和SMMC-7721/LV-GFP細胞接種于裸鼠皮下構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型，動態(tài)觀察2組裸鼠皮下移植瘤生長的差異。同時，通過尾靜脈注射重組肝癌SMMC-7721/LV-AQP9細胞和SMMC-7721/LV-GFP細胞構(gòu)建肝癌肺轉(zhuǎn)移模型，觀察2組裸鼠肺表面癌結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量，并采用HE染色觀察肺組織中轉(zhuǎn)移瘤的情況。
　　(第三部分）蛋白免疫印跡法檢測AQP9過表達重組肝癌S

4、MMC-7721/LV-AQP9細胞和SMMC-7721/LV-GFP細胞中EMT相關(guān)蛋白（E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin），PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白PI3K、AKT、p-AKT及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2、MMP9的表達差異。采用免疫組化法檢測移植瘤組織中 E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin蛋白表達。
　　結(jié)果：（第一部分）肝癌細胞株Hep3B不表達AQP9，而SMMC

5、-7721、HepG2、Huh-7中AQP9 mRNA和AQP9蛋白表達均較正常肝細胞株L02顯著降低（P值均＜0.05），其中SMMC-7721中AQP9 mRNA和AQP9蛋白表達量最低。激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，重組慢病毒LV-AQP9在SMMC-7721細胞中的轉(zhuǎn)染效率為90％左右，并通過GFP熒光信號定位發(fā)現(xiàn)，AQP9-GFP融合蛋白綠色熒光主要分布在SMMC-7721/LV-AQP9細胞的細胞膜上。在SMMC-7721/L

6、V-AQP9重組細胞模型（AQP9組）中AQP9蛋白表達量較空載對照組SMMC-7721/LV-GFP細胞（GFP組）顯著增加（P＜0.01）。在低滲狀態(tài)下SMMC-7721/LV-AQP9重組細胞（AQP9組）膨脹體積較SMMC-7721/LV-GFP細胞（GFP組）顯著增大（P＜0.05），而用HgCl2（AQP9阻滯劑）阻滯水通道蛋白活性后，在低滲狀態(tài)下SMMC-7721/LV-AQP9重組細胞（AQP9組）和SMMC-7721/

7、LV-GFP細胞（GFP組）膨脹體積無顯著差異（P=0.783）。劃痕實驗顯示，AQP9組細胞48h的遷移率（6.38%±1.70%）較GFP組（16.74%±1.40%）下降(P＜0.01)。Transwell實驗結(jié)果顯示，AQP9組48h穿過小室細胞數(shù)（57±8）較GFP組（95±11）減少（P＜0.01）。
　?。ǖ诙糠郑﹦游锼剑诼闶笃は乱浦擦瞿Ｐ椭?，重復測量方差分析2組移植瘤體積提示，AQP9組移植瘤體積顯著小于GF

8、P組（F分組＝79.161，P分組＝0.000），AQP9組皮下移植瘤生長速度明顯小于GFP組（F分組×時間＝18.481，P分組×時間＝0.002）。在裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型中，HE染色觀察AQP9組裸鼠肺組織中轉(zhuǎn)移瘤體較GFP組更小，AQP9組裸鼠肺表面癌結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量較GFP組顯著減少（P＜0.05）。
　?。ǖ谌糠郑￤estern blot檢測結(jié)果顯示AQP9過表達后上皮表型標志物（E-cadherin）、PI3K、P-AKT蛋白

9、表達上調(diào)（P值均＜0.05），間皮表型標志物（N-cadherin）表達下調(diào)（P＜0.05），而Vimentin、Akt、MMP9、MMP2蛋白表達水平較GFP組均無明顯變化（p值均＞0.05）。同樣，免疫組化及光密度分析結(jié)果顯示，AQP9組移植瘤中E-cadherin蛋白表達水平較GFP組上調(diào)（P＜0.05），AQP9組移植瘤中N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平較GFP組下調(diào)（P＜0.01）。
　　結(jié)論：肝癌細胞