雙緩釋殼聚糖溫敏凝膠的制備及用于牙周組織再生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：牙周病是導(dǎo)致成年人失牙的主要原因之一，嚴(yán)重影響人類的身體健康和生活質(zhì)量。如何使已破壞的牙周支持組織重新修復(fù)再生是牙周病治療中的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。目前廣泛開展的牙周骨移植、引導(dǎo)組織再生、引導(dǎo)骨再生等技術(shù)因植入材料缺乏主動(dòng)誘導(dǎo)組織再生修復(fù)的能力，從而未能達(dá)到理想的牙周組織再生目標(biāo)；外源性生長因子的應(yīng)用具有激發(fā)牙周組織修復(fù)潛能的明確作用，但是，如何使生長因子持續(xù)高效發(fā)揮作用還未很好解決，從而使得外源性生長因子的應(yīng)用受到限制。此外，牙周再生手術(shù)

2、操作空間狹小、視野受限，復(fù)雜的操作通常難以進(jìn)行，這與大量的牙周組織再生需求反差強(qiáng)烈。還有，由于牙周組織所處的口腔環(huán)境因素，牙周再生手術(shù)術(shù)后易受污染而影響手術(shù)效果甚至導(dǎo)致手術(shù)失敗。 研究目的 本研究嘗試將最近幾年才被提出的新型載藥系統(tǒng)殼聚糖溫敏凝膠，結(jié)合環(huán)糊精包合技術(shù)，制備成能夠同時(shí)緩釋生長因子（rhBMP-2）和抑菌成分（氯己定）的載藥凝膠，應(yīng)用于牙周組織的修復(fù)再生。該載藥系統(tǒng)的特點(diǎn)是保存條件下以溶液狀態(tài)存在，并保持生理

3、中性，當(dāng)溫度達(dá)到37℃時(shí)立即發(fā)生相轉(zhuǎn)變，形成半固體凝膠。通過實(shí)驗(yàn)，希望獲得具備生長因子和抑菌劑雙緩釋的功能性溫敏凝膠，并通過使用該凝膠系統(tǒng)獲得操作簡便并且術(shù)后感染率低、組織修復(fù)再生效果好的牙周組織再生方法。 方法與結(jié)果 1．殼聚糖溫敏凝膠的制備與性能 用不同濃度的殼聚糖溶液和β-甘油磷酸鈉溶液制備溫敏凝膠，測(cè)量其在37℃時(shí)膠凝的時(shí)間，優(yōu)選制備工藝，通過軟固體測(cè)量儀、旋轉(zhuǎn)粘度儀、掃描電鏡以及高效液相技術(shù)等測(cè)量凝膠的

4、強(qiáng)度、穩(wěn)定性、降解性、體外釋放骨形態(tài)發(fā)生蛋白替代物以及體外釋放氯己定的效能，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察殼聚糖溫敏凝膠與牙周膜細(xì)胞的相容性。 結(jié)果顯示，2％殼聚糖（脫乙酰度為91％）與12％的β-甘油磷酸鈉配置時(shí)獲得了性狀良好的殼聚糖-甘油磷酸鈉溫敏凝膠系統(tǒng)。溶液pH值為7.11±0.03，在37℃條件下，溶液經(jīng)8min轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的半固體凝膠。凝膠強(qiáng)度為（4.6±0.3）×104 Pa，接近于1.5％瓊脂糖凝膠。在凝膠中加載骨形態(tài)發(fā)生蛋白

5、的操作簡便，凝膠對(duì)蛋白具有較好的緩釋效能，緩釋作用長達(dá)一月以上。凝膠內(nèi)直接加載氯己定不能獲得氯己定的緩釋，氯己定在10余小時(shí)即釋放完畢。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞可以方便的加載于凝膠中，并在其中伸展，顯示殼聚糖溫敏凝膠有較好的細(xì)胞相容性。 2．雙緩釋殼聚糖溫敏凝膠的制備及性能 通過飽和水溶液法制備β-環(huán)糊精與氯己定的包合物，并通過掃描電鏡、紅外光譜掃描、紫外光譜掃描鑒定包合物的性質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，共混包合物以及骨

6、形態(tài)發(fā)生蛋白替代物于殼聚糖溫敏凝膠中，對(duì)比檢測(cè)加載包合物前后凝膠的膠凝特性、穩(wěn)定性以及在同一體系內(nèi)對(duì)氯己定和骨形態(tài)發(fā)生蛋白替代物的緩釋效能。 結(jié)果顯示：通過鑒定，成功獲得β-環(huán)糊精與氯己定的包合物。包合率為40.11％。目標(biāo)藥物共混于殼聚糖溫敏凝膠之后，凝膠系統(tǒng)仍然能夠在37℃時(shí)形成穩(wěn)定凝膠，對(duì)蛋白藥物的緩釋效能未發(fā)生變化，而對(duì)氯己定的緩釋作用明顯增強(qiáng)，緩釋時(shí)間長達(dá)一月以上。 3．雙緩釋殼聚糖溫敏凝膠用于牙周組織再生的實(shí)

7、驗(yàn)研究 制備犬前磨牙Ⅱ度根分叉牙周組織缺損模型，先行嚴(yán)密縫合組織瓣，然后分五組于牙周組織缺損處分別注入①加載氯己定/β-環(huán)糊精包合物和rhBMP-2的殼聚糖溫敏凝膠（T1組）②加載rhBMP-2的殼聚糖溫敏凝膠（T2組）③加載氯己定/β-環(huán)糊精包合物的殼聚糖溫敏凝膠（T3組）④單純殼聚糖溫敏凝膠（C1組）⑤不注射任何藥物（C0組）。術(shù)后不使用抗生素，常規(guī)護(hù)理，8w后對(duì)實(shí)驗(yàn)犬進(jìn)行插管灌注固定，取材，大體及組織學(xué)切片觀察牙齦炎癥情況

8、及牙周缺損處的組織再生情況。 結(jié)果顯示：應(yīng)用殼聚糖溫敏凝膠，可以方便地通過注射方式局部安放載體。而且，T1組、T2組獲得明顯的牙周組織再生；牙齦炎癥細(xì)胞浸潤情況顯示T1組及T3組炎細(xì)胞數(shù)量明顯少于其他組。而且，T1組較T2和T3組有更好的組織再生結(jié)果。表明殼聚糖溫敏凝膠作為載體在用于牙周組織缺損的再生治療時(shí)有效發(fā)揮了rhBMP-2和氯己定各自的作用。初步證明，rhBMP-2和氯己定雙緩釋殼聚糖溫敏凝膠用于牙周組織再生治療具有簡便

9、性和有效性，而且，雙緩釋rhBMP-2和氯己定較僅緩釋其中一種促進(jìn)組織再生的效果更好。 4．殼聚糖化學(xué)固載環(huán)糊精新材料的研究 通過化學(xué)合成方法，將環(huán)糊精分子化學(xué)結(jié)合到殼聚糖分子的羥基（保留殼聚糖分子的氨基）上，制備殼聚糖固載環(huán)糊精的新材料，旨在獲得更好的雙緩釋載體材料。通過紅外光譜分析及核磁共振分析進(jìn)行新材料鑒定。 結(jié)果：合成的新材料為淡黃色固體粉末，紅外測(cè)定結(jié)果與核磁共振譜測(cè)定結(jié)果表明，環(huán)糊精分子固載于殼聚糖的

10、羥基上，β-環(huán)糊精表觀固載量經(jīng)測(cè)定為42％。合成反應(yīng)總收率為29％。新材料兼有殼聚糖和β-環(huán)糊精的雙重結(jié)構(gòu)及特性，可望成為新型雙緩釋載體材料應(yīng)用于生物材料領(lǐng)域。 結(jié)論 1．通過共混rhBMP-2和氯己定/β-環(huán)糊精包合物可以獲得rhBMP-2與氯己定雙緩釋的殼聚糖溫敏凝膠，該系統(tǒng)在4℃條件下呈穩(wěn)定的溶液狀態(tài)，37℃時(shí)經(jīng)8min轉(zhuǎn)化成半固體凝膠，緩釋rhBMP-2與氯己定一月以上，與牙周膜細(xì)胞相容，可生物降解，應(yīng)用于根分叉