可注射溫敏殼聚糖-膠原-甘油磷酸鈉水凝膠應用于骨組織工程的初步研究.pdf

1、可注射的對pH或者溫度敏感的智能水凝膠材料,近些年來被研究者廣泛的關注.首先它可以在體外以流動性很好的液態(tài)形式復合藥物,生長因子以及細胞等,然后以微創(chuàng)的方式,通過注射器或者內窺鏡植入體內的器官或者缺損部位,因溫度或者其他因素的影響,快速在原位形成凝膠,發(fā)揮其功效.
　　 殼聚糖是一種天然的多聚物,酸性環(huán)境下可以以液體形式存在,是甲殼素部分脫乙酰后的產(chǎn)物,具有天然的抗菌性和可生物降解和生物相容性好的優(yōu)點。之前有研究者利用酸性的殼聚

2、糖溶液,與一種弱堿性物質,β-甘油磷酸鈉(beta-glycerophosphate,GP)混合,制備了一種對溫度敏感的殼聚糖/GP可注射凝膠,由于殼聚糖的結構和糖胺聚糖相似等優(yōu)點,此類材料被廣泛應用于軟骨缺損,髓核再生修復等領域,取得了良好的效果。
　　 同時由于殼聚糖在骨組織工程研究中體現(xiàn)出的良好性能,諸如促進成骨細胞生長等,使得殼聚糖/GP水凝膠材料被引入到骨組織工程的研究中來。但是,考慮到單一的殼聚糖被證明促成骨作用有限

3、,本研究引入了另一種被廣泛應用的天然生物材料,Ⅰ型膠原,到殼聚糖/GP水凝膠中去。
　　 Ⅰ型膠原是一種天然的骨組織的細胞外基質(ECM),同時,很多實驗證明其對促成骨細胞吸附和支持生長其著良好的作用。所以,本實驗致力于構建一種殼聚糖/膠原/GP為基底的復合的溫敏水凝膠支架材料.并且對它的理化性能,比如pH值、凝膠時間、滲透壓、超微結構等進行檢測.同時著重檢測此水凝膠支架材料對骨髓基質細胞以及牙周膜細胞的生物相容活性,觀察細胞在

4、材料中的生長以及分化特性.最后將此種材料復合犬骨髓基質細胞和人牙周膜細胞植入裸鼠皮下,觀察其在體內的生物相容性,檢測其成骨性能,研究此殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架應用于骨組織工程的潛力,本實驗主要由以下幾部分構成.
　　 第一部分殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架的構建及理化性能分析
　　 目的:構建一種方便操作、適合作為細胞載體、理化性能好的可注射殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架.
　　 方法:按一定比例先后混合殼聚糖、

5、膠原、GP溶液,制備殼聚糖/膠原/GP水凝膠.通過倒置試管觀察流動性記錄其凝膠時間,pH計,滲透壓計等記錄其理化指標.
　　 結果:制備的殼聚糖/膠原/GP水凝膠pH值為7.09-7.21,凝膠時間約為8分鐘.其在普通培養(yǎng)液中的滲透壓為295-315mmol/kg.
　　 結論:具有生理pH和滲透壓的殼聚糖/膠原/GP水凝膠適合應用于后續(xù)的體內,體外研究.8分鐘左右的凝膠時間也便于操作者將其作為載體,在液態(tài)下復合細胞,藥

6、物等物質,進行后續(xù)的體內體外實驗.
　　 第二部分殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架材料對BMSCs的細胞毒性檢測,細胞在支架內超微結構觀察,殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架應用于骨組織工程的評估
　　 目的:檢測殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架對骨髓基質細胞的生物學毒性,以及材料本身的成骨性能,評估其用于骨組織工程的潛力
　　 方法:1.接種一定數(shù)量的BMSCs于殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架,37度孵箱內低糖培養(yǎng)基培養(yǎng),分別

7、于1天和7天使用live/dead細胞活性檢測試劑盒檢測細胞在支架內的活性.2.同法接種一定量細胞于支架中,一部分帶細胞支架在普通低糖培養(yǎng)基孵育三天后對細胞進行掃描電鏡觀察,另一部分帶細胞支架經(jīng)成骨誘導28天時,進行掃描電鏡觀察.3.將預先成骨誘導一周的BMSCs接種于裸鼠皮下,4周后取材進行組織學以及免疫組織化學的檢測.所有實驗均采用殼聚糖/GP支架進行對照.
　　 結果:1.超過95％的受試細胞依然在兩種支架中存活.2.掃描

8、電鏡下見,殼聚糖/GP支架中的細胞未充分伸展且較難與殼聚糖小球分辨,而細胞在殼聚糖/膠原/GP支架內伸展良好,清晰可辨.在28天成骨誘導的BMSCs-殼聚糖/膠原/GP支架內觀察到了數(shù)量較多的骨礦化結節(jié)樣結構.3.組織學結果顯示,BMSC-殼聚糖/膠原/GP組中觀察到了自發(fā)生成的血管以及類骨樣結構,其余組未見.
　　 結論:殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架適合骨髓基質細胞生長,支持預礦化誘導的細胞在支架中繼續(xù)成骨分化,有著很好的骨組

9、織工程支架材料的應用潛力.
　　 第三部分殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架對HPLCs的生物相容性檢測,細胞支架復合材料的超微結構觀察,殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架應用于牙周骨組織缺損修復的可行性分析
　　 目的:檢測殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架對HPLCs的細胞生物相容性,超微結構下細胞在支架材料內的生長,評估殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架應用于牙周組織工程的潛力
　　 方法:1.同實驗二部分,檢測1,7天時細胞在材

10、料中的活性.2.同實驗二部分,掃描電鏡觀察超微結構下細胞在材料內的生長與成骨分化.3.在接種細胞到材料的同時,復合一定量的bmp-2于支架中,植入裸鼠皮下,兩周后取材,組織學檢測.
　　 結果:1.與BMSCs相似,同樣有超過95％的細胞在支架材料中存活.2.HPLCs在支架材料中伸展良好,經(jīng)過4周的體外成骨誘導培養(yǎng)的支架中同樣發(fā)現(xiàn)礦化結節(jié)樣結構.3.兩周的裸鼠皮下植入物組織學結果顯示,實驗組的材料內顯現(xiàn)明顯的軟骨細胞以及成骨樣