中華蜜蜂AccCYP336A1和AccCYP18A1基因的分離與表達(dá)特性分析.pdf

1、細(xì)胞色素 P450（P450）是多功能氧化酶的核心酶系，參與昆蟲殺蟲劑的代謝以及蛻皮激素、保幼激素等激素的合成，與昆蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和防御密切相關(guān)。另外，這些酶與過(guò)氧化物酶有類似的活性，因此可能在保護(hù)生物體免受活性氧損傷的過(guò)程中發(fā)揮作用。本研究以我國(guó)特色種質(zhì)資源中華蜜蜂（Apis cerana cerana）為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)意大利蜜蜂（Apis mellifera）的同源序列，利用RT-PCR和RACE-PCR的方法從中華蜜蜂中首次克隆得

2、到了P450家族CYP3分支和CYP2分支的CYP336A1和CYP18A1兩個(gè)基因，并且分別命名為AccCYP336A1和AccCYP18A1。然后進(jìn)一步對(duì)它們進(jìn)行了序列比對(duì)、表達(dá)特性分析以及功能預(yù)測(cè)。具體的結(jié)果如下：
　　（1）AccCYP336A1開放閱讀框全長(zhǎng)1491bp，編碼一個(gè)含有496個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為57kDa，等電點(diǎn)為8.8。AccCYP18A1開放閱讀框全長(zhǎng)1620bp，編碼一個(gè)含有539個(gè)氨基酸

3、殘基的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為60.7kDa，等電點(diǎn)為8.42。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，AccCYP336A1、AccCYP18A1與其他物種中P450家族基因的同源性較高，且具有該家族保守的功能區(qū)域。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，AccCYP336A1和AccCYP18A1分別屬于CYP3分支和CYP2分支。
　?。?）采用qRT-PCR的方法分別對(duì)兩個(gè)基因在中華蜜蜂不同發(fā)育時(shí)期和不同組織部位中的表達(dá)特性進(jìn)行了分析。qRT-PCR結(jié)果表明，AccCYP

4、336A1和AccCYP18A1在整個(gè)中華蜜蜂的變態(tài)發(fā)育過(guò)程中均有表達(dá)，AccCYP336A1在卵期的表達(dá)量最高，而AccCYP18A1在變態(tài)發(fā)育的兩個(gè)重要發(fā)育節(jié)點(diǎn)：5日齡幼蟲（L5）及1日齡成蜂（A1）時(shí)期表達(dá)量最高。以上結(jié)果表明，AccCYP336A1及 AccCYP18A1可能與中華蜜蜂的變態(tài)發(fā)育有關(guān)。另外，中華蜜蜂不同組織部位中的表達(dá)特性顯示，AccCYP336A1在表皮中表達(dá)量最高，而AccCYP18A1在中腸中表達(dá)量最高。這

5、些結(jié)果初步表明了兩個(gè)基因的組織特異性。
　?。?）采用qRT-PCR的方法分別對(duì)兩個(gè)基因在不同非生物應(yīng)激中的表達(dá)模式進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，AccCYP336A1、AccCYP18A1兩個(gè)基因的表達(dá)受高溫、低溫、紫外線和殺蟲劑等非生物應(yīng)激的誘導(dǎo)。這些結(jié)果表明，這兩個(gè)基因在中華蜜蜂抗逆、抗氧化過(guò)程中起到重要作用。
　?。?）采用Western-blot的方法分別對(duì)兩個(gè)基因所編碼蛋白在不同非生物應(yīng)激中的表達(dá)特性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示