中華蜜蜂抗螨相關(guān)基因篩選及表達(dá)分析.pdf

1、狄斯瓦螨(Varroa destructor)被認(rèn)為是威脅全球蜂群健康的主要因素之一，對全世界的養(yǎng)蜂業(yè)都造成了巨大損失。中華蜜蜂作為蜂螨的原始寄主，具有較強(qiáng)的清理能力，能夠抵抗螨蟲的侵害。為探求中華蜜蜂抗螨行為的分子機(jī)制，本文以中華蜜蜂(Apis cerana cerana)為研究對象，通過對染螨前后的中華蜜蜂進(jìn)行Solexa/ Illumina高通量轉(zhuǎn)錄組測序，初步篩選出與中華蜜蜂抗螨行為相關(guān)的候選差異基因，并采用RT-PCR和熒光定

2、量PCR的技術(shù)，分析了候選差異基因中mab-21和Calcineurin B在中華蜜蜂不同發(fā)育階段的表達(dá)差異，并對候選基因進(jìn)行序列及表達(dá)特征分析。主要結(jié)果如下：
　　1、通過高通量測序技術(shù)檢測染螨前后的中華蜜蜂轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異，將獲得的clean reads從頭組裝獲得31739個Unigenes，平均長度為6067bp，并對這些Unigenes進(jìn)行基因功能注釋。基于數(shù)據(jù)庫Nr、GO和KEGG用BlastX進(jìn)行相似性比對，共有297

3、92個Unigenes被注釋。以未染螨中華蜜蜂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參考數(shù)據(jù)，對染螨前后的中華蜜蜂進(jìn)行分析比較，在染螨后的中華蜜蜂共檢測到513個基因有顯著表達(dá)差異，其中502個基因上調(diào)，11個基因下調(diào)。
　　2、從中華蜜蜂轉(zhuǎn)錄組差異基因中篩選得到mab-21基因。采用RT-PCR方法，獲得中華蜜蜂mab-21 cDNA，克隆了中華蜜蜂mab-21的基因編碼區(qū)，命名為Accmab21，并提交GenBank后獲得登錄號KR000001。序列分

4、析結(jié)果顯示,中華蜜蜂mab-21基因的編碼區(qū)開放閱讀框長為1098 bp，共編碼365個氨基酸，推測編碼蛋白的相對分子量為41.63 kD，等電點(diǎn)為8.53。對mab-21的系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行了分析，表明中華蜜蜂mab-21與西方蜜蜂(Apis mellifera) mab-21、小蜜蜂(Apis florea) mab-21和熊蜂(Bombus impatiens) mab-21聚成一支。
　　3、對中華蜜蜂mab-21在不同發(fā)育時期

5、（新出房蜂、哺育蜂、守衛(wèi)蜂及采集蜂）工蜂頭部中mRNA的表達(dá)量以及感染大蜂螨前后的表達(dá)特性進(jìn)行了研究。Real-time PCR結(jié)果顯示，mab-21基因在中華蜜蜂不同發(fā)育時期的工蜂頭部均有所表達(dá)，其中哺育蜂階段顯著高于新出房蜂、守衛(wèi)蜂和采集蜂(P<0.05)。感染大蜂螨后，哺育蜂和守衛(wèi)蜂中mab-21基因的表達(dá)下降顯著(P<0.05)；而在新出房蜂和采集蜂中表達(dá)量變化不顯著。該基因可能與中華蜜蜂抗螨行為相關(guān)。
　　4、從中華蜜蜂

6、轉(zhuǎn)錄組差異基因中篩選得到Calcineurin B基因。鈣調(diào)磷酸酶B（Calcineurin B， CnB）是鈣調(diào)磷酸酶的調(diào)節(jié)亞基，鈣調(diào)磷酸酶在動植物鈣信號傳導(dǎo)中起重要作用。采用RT-PCR方法克隆了中華蜜蜂Calcineurin B基因編碼區(qū)。結(jié)果表明：該編碼區(qū)開放閱讀框（ORF）長為513 bp，可編碼170個氨基酸殘基，相對分子量為19.36 Da，等電點(diǎn)為4.33。同源性比較發(fā)現(xiàn)，中華蜜蜂CnB的氨基酸序列與西方蜜蜂(A. me

7、llifera)同源性最高，高達(dá)99.4％，與熊蜂(B.impatiens)、赤擬谷盜(Tribolium castaneum)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、家蠶(Bombyx mori)較高，分別為97.1%、97.6%、94.7%和96.5%。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析可知中華蜜蜂與西方蜜蜂(A. mellifera)、大蜜蜂(A. dorsata)、小蜜蜂(A. florea)等膜翅目昆蟲的CnB匯成一支。

8、
　　5、對Calcineurin B基因在中華蜜蜂不同發(fā)育時期（新出房蜂、哺育蜂、守衛(wèi)蜂及采集蜂）工蜂頭部中mRNA的表達(dá)量以及感染大蜂螨前后的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了研究。熒光定量PCR結(jié)果表明，Calcineurin B基因在中華蜜蜂工蜂頭部的不同發(fā)育時期均有表達(dá)，各階段表達(dá)量由高到低為：守衛(wèi)蜂>采集蜂>哺育蜂>新出房蜂(P<0.05)。感染大蜂螨后，新出房蜂和哺育蜂中Calcineurin B基因的表達(dá)顯著增加(P<0.05)；而采