中華蜜蜂(Apiscerana cerana) LSD-1基因的克隆及其表達(dá)特性分析.pdf

1、PAT家族蛋白是脂肪滴（lipid droplet，LD）表面主要結(jié)構(gòu)蛋白，在脂肪代謝過(guò)程中具有重要的作用，參與脂滴的合成、分解和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。目前，關(guān)于PAT家族蛋白的研究主要集中在哺乳動(dòng)物中，而在昆蟲(chóng)中的報(bào)道很少。在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的PAT家族蛋白成員包括脂滴包被蛋白（perilipin）、脂肪分化相關(guān)蛋白（ADRP）、47kD的尾連蛋白（TIP47）、S3-12和氧化型PAT蛋白（OXPAT）。昆蟲(chóng)的基因組只能編碼兩種PAT家族蛋白，即

2、脂肪儲(chǔ)存小滴蛋白1（LSD-1）和脂肪儲(chǔ)存小滴蛋白2（LSD-2）。LSD-1作為昆蟲(chóng)脂滴表面重要的PAT家族蛋白直接參與脂肪代謝的調(diào)控。本文以中華蜜蜂（Apis cerana cerana）為實(shí)驗(yàn)材料，首次從中華蜜蜂中克隆得到LSD-1基因（AccLSD-1），并對(duì)其進(jìn)行了序列比對(duì)，表達(dá)特性分析及初步功能鑒定，為進(jìn)一步研究該基因的功能及作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　 ⑴利用RT-PCR和RACE-PCR的方法，首

3、次從中華蜜蜂中克隆得到了LSD-1基因，命名為AccLSD-1。并將該基因在Genbank注冊(cè)，其注冊(cè)號(hào)為GU722328。序列分析結(jié)果表明，AccLSD-1cDNA全長(zhǎng)為1313 bp，包括1161 bp的開(kāi)放閱讀框（ORF）,40 bp的5′非編碼區(qū)（5′UTR）和112 bp的3′非編碼區(qū)（3′UTR）。該基因編碼一個(gè)386個(gè)氨基酸殘基的多肽，預(yù)測(cè)分子量為42.6 kDa。通過(guò)同源性比較發(fā)現(xiàn)，中華蜜蜂LSD-1與其它昆蟲(chóng)LSD-1

4、的同源性很高。AccLSD-1含有昆蟲(chóng)LSD-1s家族所有的PKA磷酸化位點(diǎn)和脂肪滴結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)化分析表明，AccLSD-1與昆蟲(chóng)LSD-1聚集成簇，而與哺乳動(dòng)物PAT家族蛋白的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。AccLSD-1基因組全長(zhǎng)5224 bp，包含8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子。其中，內(nèi)含子1位于5′UTR內(nèi)，推測(cè)該內(nèi)含子可能具有特殊的功能。
　　 ⑵通過(guò)LA-PCR和I-PCR的方法獲得 AccLSD-1基因的啟動(dòng)子序列。利用分析軟件 TFBI

5、ND 對(duì)其進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列除了存在典型的 TATA box和 CAAT box外，還存在多個(gè)響應(yīng)脂肪代謝的特殊作用元件，如PPARγ響應(yīng)元件和C/EBPα元件。另外，還發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)響應(yīng)環(huán)境應(yīng)激的作用元件，如熱響應(yīng)元件和T細(xì)胞響應(yīng)元件。
　　 ⑶利用Real-time PCR的方法，研究了AccLSD-1在不同發(fā)育時(shí)期mRNA水平的表達(dá)情況。研究表明，AccLSD-1在中華蜜蜂的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中均有表達(dá)。在幼蟲(chóng)時(shí)期（3日齡至5日齡

6、），AccLSD-1表達(dá)量隨日齡的增加逐漸升高。在成蟲(chóng)時(shí)期，AccLSD-1在25日齡青年蜂的表達(dá)量明顯高于2日齡幼蜂和50日齡老年蜂的表達(dá)量。然而，在蛹期AccLSD-1表達(dá)呈現(xiàn)拋物線的趨勢(shì)且在Pb時(shí)期有最高表達(dá)量。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在中華蜜蜂蛻變時(shí)期（無(wú)論是幼蟲(chóng)蛻變成蛹還是蛹蛻變成成蟲(chóng)）AccLSD-1的表達(dá)量都明顯降低。
　　 ⑷利用室內(nèi)人工飼養(yǎng)的方法，檢測(cè)了AccLSD-1在不同濃度的共軛亞油酸或羅格列酮誘導(dǎo)下mRNA水平的表達(dá)

7、情況。結(jié)果表明，AccLSD-1轉(zhuǎn)錄水平受羅格列酮的誘導(dǎo)而升高，而添加共軛亞油酸能降低AccLSD-1的表達(dá)量。與只添加共軛亞油酸組相比，同時(shí)添加共軛亞油酸和羅格列酮能明顯提高AccLSD-1的表達(dá)量。
　　 ⑸從AccLSD-1中選取N端600氨基酸片段構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-AccLSD-1-600，并在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)融合蛋白，將強(qiáng)誘導(dǎo)帶切下，溶于PBS中獲得抗原，并免疫小鼠制備抗體，其抗血清效價(jià)為1：20