中華蜜蜂(Apis cerana cerana)MRJP2基因的原核表達.pdf

1、蜜蜂作為昆蟲大家族中的一員,長期以來被視為一個很好的研究對象,而且一直是國內外研究的熱點。中華蜜蜂(Apis cerana cerana)為東方蜜蜂中重要的亞種之一,長期適應于我國的地理特征和氣候條件,是我國特有的蜜蜂資源,具有其它蜂種不可替代的資源優(yōu)勢和研究價值。蜂王漿(Royal Jelly,RJ)是哺育蜂咽下腺與上顎腺分泌的供3日齡以內蜜蜂幼蟲和蜂王食用的漿狀物質。蜂王漿已被報道具有多種醫(yī)療保健和生物學功能,對蜂王漿成分及其功能的

2、研究一直是國內外蜂學研究的重要領域。蜂王漿的許多功能由其所含的蛋白組分產(chǎn)生,王漿蛋白由水溶性蛋白和非水溶性蛋白組成,其中水溶性蛋白占總蛋白含量的46％～89％,為王漿蛋白的主要部分,稱為主要王漿蛋白(Major Royal Jelly Proteins,MRJPs)。目前,王漿蛋白分子水平方面的研究主要集中在MRJPs家族。
　　 本研究從已構建的8日齡中蜂的工蜂頭部cDNA文庫中篩選到MRJP2基因,成功獲得該基因的全長eDN

3、A序列。此序列包含一個1407 bp的開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF),編碼一個由468個氨基酸殘基組成的蛋白,預測分子量為53.06kDa,等電點為8.102。本研究首先通過PCR方法從AccMRJP2基因的全長eDNA序列中擴增出整個ORF,再經(jīng)EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切后將其插入經(jīng)同樣雙酶切過的原核表達載體pET-28a(+)上,獲得重組質粒pET-28a(+)-AccMRJP2,后通過PCR鑒定、雙酶切

4、鑒定以及測序分析證實重組質粒構建正確后,再將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,IPTG誘導表達AccMRJP2重組蛋白,最后經(jīng)SDS-PAGE檢測融合蛋白表達情況,結果顯示無特異性條帶出現(xiàn),之后重復多次試驗也沒有檢測到目的蛋白的表達,因此我們隨后考慮對AccMRJP2基因進行分段克隆,同時也進行全長基因的表達作為對照。為了避免信號肽可能產(chǎn)生的負作用,我們在進行實驗前先將存在于此基因中的信號肽序列去除,并根據(jù)需要設計出四對

5、合適的引物,再經(jīng)PCR擴增出各目的基因片段,長度分別為420 bp、486 bp、498 bp和1356 bp,隨后分別構建重組質粒pET-28a(+)-AccMRJP2,并鑒定各重組子是否構建成功,再將各重組質粒分別轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,最后經(jīng)IPTG誘導表達帶His標簽的AeeMRJP2各片段的融合蛋白及全蛋白,并將其分別命名為His-420、His-486、His-498和His-1356,對應的分子量分別為1

6、9.7 kDa、21.5 kDa、22.4 kDa和54.8 kDa(融合標簽3.56kDa)。SDS-PAGE檢測各融合蛋白的表達情況,結果發(fā)現(xiàn)His-420、His-486和His-498均出現(xiàn)各自的特異性條帶,但都是以包涵體的形式出現(xiàn);而His-1356沒有出現(xiàn)特異性條帶,隨后也進行了多次重復實驗,始終沒有發(fā)現(xiàn)目的蛋白的表達。為了進一步探索每種蛋白的最適表達條件,我們也對各融合蛋白的表達條件進行了優(yōu)化,分別設計了9組在不同誘導時間

7、、誘導溫度和誘導劑濃度條件下的表達實驗,同樣經(jīng)SDS-PAGE檢測各融合蛋白的表達情況。結果顯示,將誘導溫度從30℃上升到37℃有利于提高His-420融合蛋白的表達量,而對其它兩種蛋白無明顯影響;改變IPTG濃度對三種蛋白的表達量影響均不大;此步實驗更進一步確定了三種融合蛋白都是以包涵體的形式出現(xiàn)的。利用Ni-NTA親和層析柱純化各融合蛋白,得到的目的蛋白純度均較高,再經(jīng)FPLC反相層析柱進一步純化,最后進行LC-MS質譜分析。質譜結