海洋微藻DNA條形碼基因的評估及環(huán)境樣本多樣性分析和定量基因的開發(fā).pdf

1、海洋微藻不僅在海洋生態(tài)系統(tǒng)中占有十分重要的生態(tài)地位，而且其結(jié)構(gòu)成分和分泌物等是巨大的可開發(fā)利用的海洋資源，而硅藻和甲藻是海洋微藻的主要類群，因此，對其進行準確地分類鑒定是其他相關(guān)工作的研究基礎(chǔ)。DNA條形碼技術(shù)作為傳統(tǒng)分類學鑒定的補充手段發(fā)揮了非常重要的作用。但硅藻和甲藻的DNA條形碼研究起步較晚，尚未找到分別適合的統(tǒng)一的DNA條形碼基因，現(xiàn)有的研究也主要是分別針對特定的分類單元進行條形碼基因的檢測，并未在整個類群上對候選基因進行過評估

2、。此外，目前對海洋微藻群落結(jié)構(gòu)的研究，一是顯微鏡檢，但該方法受限于形態(tài)學鑒定的局限性，二是利用rDNA的擴增子測序信息來反映群落中微藻的組成結(jié)構(gòu)，但rDNA在不同真核生物中的的拷貝數(shù)差異很大。因此根據(jù)rDNA擴增子測序所得的序列豐度對環(huán)境樣本中真核微生物群落的相應物種的豐度評估可能存在誤差。一些拷貝數(shù)較少的核編碼的蛋白基因已被用于甲藻的系統(tǒng)發(fā)育分析，將此類基因用于群落結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果應該會更加準確。
　　因而，本文針對研究較為廣泛的

3、硅藻，對選取的候選條形碼基因18S rDNA、ITS rDNA、COI和rbcL，分別進行通用引物的設計和驗證，聯(lián)合NCBI上的序列計算硅藻門各基因的遺傳差異并構(gòu)建貝葉斯樹，評估其在硅藻門內(nèi)物種的聚類情況，以分析各段標記適用于硅藻聚類關(guān)系中的分類單位;然后利用硅藻模擬混合樣本進行rDNA擴增子克隆測序，評估rDNA序列的豐度反應環(huán)境樣本中真核微生物群落的相應物種豐度的準確性;并對具有一定的甲藻物種區(qū)分能力的拷貝數(shù)較低的核編碼蛋白基因（H

4、SP90、elf2、actin）設計通用引物，分析其對甲藻物種的區(qū)分度后，利用甲藻模擬群落和選定的actin基因構(gòu)建克隆文庫初步評估該基因?qū)自逦锓N進行定量的準確性;最后比較18S v9區(qū)和actin基因的Miseq測序測序結(jié)果，進行硅藻和甲藻模擬群落的物種豐度和多樣性分析，并建立基因序列與生物量之間的關(guān)系。得到的結(jié)果如下:
　　利用設計的通用引物將18S rDNA、ITS rDNA、COI和rbcL基因在分離的37株硅藻中均獲得

5、了擴增和測序，測得的序列Blast結(jié)果顯示，rbcL基因的正確率最高(88.9％)，18S次之，而COI的錯誤率最高(25％)。遺傳差異和構(gòu)建的貝葉斯樹顯示，18S rDNA的遺傳變異度比較適中，可以在較高的分類水平上對硅藻進行聚類，也可以對直鏈藻屬、楔形藻屬、骨條藻屬和雙肋藻科等較低分類單位進行聚類分析。ITS和COI基因在硅藻門內(nèi)遺傳變異的程度很大，不再適用于較高分類單位的聚類分析，但是ITS適合用于海鏈藻目物種的DNA條形碼鑒定和

6、系統(tǒng)發(fā)育分析，而COI則更適合于羽紋硅藻的一些屬的物種聚類分析和DNA條形碼鑒定。rbcL基因相對18S更加保守，但是并不能在高分類階元上進行硅藻的聚類分析，卻可以聚類異極藻屬、骨條藻屬、冠盤藻科和根管藻科等個別較低分類單位的物種序列。
　　利用rDNA擴增子測序進行微藻群落中物種豐度的分析結(jié)果，以DNA為模板比以藻液為模板所構(gòu)建的克隆文庫檢測到的物種多，但都只檢測出少量物種并存在相同的物種擴增偏好性，且兩個文庫檢測到的物種的比例

7、與樣本的細胞比例差異很大，一方面說明rDNA在不同硅藻物種中的拷貝數(shù)存在很大差異，另一方面說明rDNA構(gòu)建克隆文庫評估硅藻群落甚至真核微生物的組成結(jié)構(gòu)存在很大誤差。同時還檢測到在不同的硅藻培養(yǎng)物內(nèi)都存在ITS序列變異，但是變異程度很小(p＜0.013)。
　　對拷貝數(shù)較少的核編碼的蛋白基因HSP90、elf2和actin基因設計通用引物并在8株甲藻中進行擴增和聚類分析，結(jié)果顯示actin基因在擴增率、序列可利用率和物種的區(qū)分能力上

8、均顯示了一定的優(yōu)勢，基本上可以將甲藻在屬水平進行區(qū)分和聚類。甲藻混合樣本的actin基因克隆文庫的構(gòu)建和分析結(jié)果顯示，actin基因能夠?qū)?個物種全部檢出，序列與細胞的比例尚存在誤差，但在屬水平的誤差要小于種水平的誤差，物種檢出率高于rDNA，豐度偏差低于rDNA。
　　采用Miseq測序?qū)?個模擬的硅藻和甲藻混合樣本分別進行了18S v9區(qū)和actin基因的測序分析結(jié)果顯示，rDNA擴增子測序進行微藻群落結(jié)構(gòu)分析的誤差很大，用1