苯并(a)芘和菲對沙蠶CYP4基因及其蛋白表達的影響.pdf

1、為了進一步揭示沙蠶CYP4對多環(huán)芳烴的代謝及解毒機制，并為沙蠶在海洋沉積環(huán)境早期生態(tài)風險評價中的應用提供理論依據。本研究根據已有雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis)細胞色素氧化酶CYP4全序列進行開放閱讀框擴增，通過體外構建原核表達系統(tǒng)，獲得沙蠶CYP4體外重組蛋白。在此基礎上探討了兩種多環(huán)芳烴（苯并（a）芘及菲）誘導下沙蠶CYP4轉錄及翻譯水平的表達規(guī)律。
　　本研究主要內容包括：⑴利用表達載體 pET-

2、28a和大腸桿菌 BL21感受態(tài)細胞構建了沙蠶 CYP4體外表達系統(tǒng)。重組蛋白體外誘導表達最適表達溫度為37℃，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）最佳誘導濃度為0.8mmol/L。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測顯示表達蛋白為包涵體。對目的蛋白進行純化及復性，通過免疫家兔，獲得沙蠶CYP4的多克隆抗體。⑵利用熒光實時定量PCR檢測方法分析了苯并芘（B(a)P）暴露下雙齒圍沙蠶CYP4轉錄水平的變化趨勢。第4d時，0.5和

3、50μg/L濃度組的沙蠶CYP4基因的表達量上調，其中0.5μg/L濃度組與空白對照組存在極顯著差異（P<0.01），其它濃度組與空白對照組未見明顯差異。至第7d，各濃度組 CYP4基因表達與對照組相比出現(xiàn)明顯升高趨勢，并且CYP4基因的表達量與B(a)P濃度成正比。其中，10μg/L和50μg/L濃度組與對照組差異顯著（P<0.05）,50μg/L濃度組與空白對照組有極顯著差異（P<0.01）。至第14d，各濃度組的CYP4基因的表達

4、量均相對下調，其中5μg/L和50μg/L濃度組的CYP4基因表達量顯著低于空白對照組（P<0.05），其它兩個濃度組與空白對照組則無顯著差異。⑶利用熒光實時定量PCR檢測方法分析了菲暴露下雙齒圍沙蠶CYP4轉錄水平的變化趨勢。菲誘導雙齒圍沙蠶CYP4基因表達水平的變化與苯并芘作用不同，至實驗第4d，各濃度組的 CYP4基因表達均表現(xiàn)為下調，且隨菲濃度的增加表達量逐漸降低；四個濃度組的CYP4基因表達量均極顯著地低于空白對照組（P<0.

5、01）。至第7d時，50μg/L濃度組CYP4基因表達量最高上調明顯，與空白對照組存在極顯著差異（P<0.01），其它濃度組 CYP4基因的表達量均上調不明顯。至第14d時，各濃度組的CYP4基因表達量均低于對照組，且各組之間無太大差異。⑷利用間接 ELISA檢測方法分析了苯并芘（B(a)P）暴露下雙齒圍沙蠶CYP4翻譯水平的變化趨勢。第4d時，各濃度組間CYP4蛋白表達量無顯著性差異。至實驗第7d，5μg/L濃度組 CYP4蛋白的表達

6、量顯著降低，與對照組存在極顯著差異（P<0.01）,其它濃度組與對照組均無顯著差異。第14d時，50μg/L濃度組CYP4蛋白表達量最高，其次為5μg/L濃度組，且與對照組存在顯著性差異（P<0.05），其它兩組與對照組無顯著差異。⑸利用間接ELISA檢測方法分析了菲暴露下雙齒圍沙蠶CYP4翻譯水平的變化趨勢。在4d時，CYP4蛋白表達量均低于對照組，并且隨菲濃度的升高呈遞減趨勢，5μg/L和10μg/L濃度組CYP4蛋白表達量均與對照