苯并(a)芘和菲對(duì)沙蠶CYP4基因及其蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、為了進(jìn)一步揭示沙蠶CYP4對(duì)多環(huán)芳烴的代謝及解毒機(jī)制，并為沙蠶在海洋沉積環(huán)境早期生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。本研究根據(jù)已有雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis)細(xì)胞色素氧化酶CYP4全序列進(jìn)行開放閱讀框擴(kuò)增，通過體外構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)，獲得沙蠶CYP4體外重組蛋白。在此基礎(chǔ)上探討了兩種多環(huán)芳烴（苯并（a）芘及菲）誘導(dǎo)下沙蠶CYP4轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的表達(dá)規(guī)律。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用表達(dá)載體 pET-

2、28a和大腸桿菌 BL21感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建了沙蠶 CYP4體外表達(dá)系統(tǒng)。重組蛋白體外誘導(dǎo)表達(dá)最適表達(dá)溫度為37℃，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）最佳誘導(dǎo)濃度為0.8mmol/L。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)顯示表達(dá)蛋白為包涵體。對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化及復(fù)性，通過免疫家兔，獲得沙蠶CYP4的多克隆抗體。⑵利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法分析了苯并芘（B(a)P）暴露下雙齒圍沙蠶CYP4轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢(shì)。第4d時(shí)，0.5和

3、50μg/L濃度組的沙蠶CYP4基因的表達(dá)量上調(diào)，其中0.5μg/L濃度組與空白對(duì)照組存在極顯著差異（P<0.01），其它濃度組與空白對(duì)照組未見明顯差異。至第7d，各濃度組 CYP4基因表達(dá)與對(duì)照組相比出現(xiàn)明顯升高趨勢(shì)，并且CYP4基因的表達(dá)量與B(a)P濃度成正比。其中，10μg/L和50μg/L濃度組與對(duì)照組差異顯著（P<0.05）,50μg/L濃度組與空白對(duì)照組有極顯著差異（P<0.01）。至第14d，各濃度組的CYP4基因的表達(dá)

4、量均相對(duì)下調(diào)，其中5μg/L和50μg/L濃度組的CYP4基因表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組（P<0.05），其它兩個(gè)濃度組與空白對(duì)照組則無顯著差異。⑶利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法分析了菲暴露下雙齒圍沙蠶CYP4轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢(shì)。菲誘導(dǎo)雙齒圍沙蠶CYP4基因表達(dá)水平的變化與苯并芘作用不同，至實(shí)驗(yàn)第4d，各濃度組的 CYP4基因表達(dá)均表現(xiàn)為下調(diào)，且隨菲濃度的增加表達(dá)量逐漸降低；四個(gè)濃度組的CYP4基因表達(dá)量均極顯著地低于空白對(duì)照組（P<0.

5、01）。至第7d時(shí)，50μg/L濃度組CYP4基因表達(dá)量最高上調(diào)明顯，與空白對(duì)照組存在極顯著差異（P<0.01），其它濃度組 CYP4基因的表達(dá)量均上調(diào)不明顯。至第14d時(shí)，各濃度組的CYP4基因表達(dá)量均低于對(duì)照組，且各組之間無太大差異。⑷利用間接 ELISA檢測(cè)方法分析了苯并芘（B(a)P）暴露下雙齒圍沙蠶CYP4翻譯水平的變化趨勢(shì)。第4d時(shí)，各濃度組間CYP4蛋白表達(dá)量無顯著性差異。至實(shí)驗(yàn)第7d，5μg/L濃度組 CYP4蛋白的表達(dá)

6、量顯著降低，與對(duì)照組存在極顯著差異（P<0.01）,其它濃度組與對(duì)照組均無顯著差異。第14d時(shí)，50μg/L濃度組CYP4蛋白表達(dá)量最高，其次為5μg/L濃度組，且與對(duì)照組存在顯著性差異（P<0.05），其它兩組與對(duì)照組無顯著差異。⑸利用間接ELISA檢測(cè)方法分析了菲暴露下雙齒圍沙蠶CYP4翻譯水平的變化趨勢(shì)。在4d時(shí)，CYP4蛋白表達(dá)量均低于對(duì)照組，并且隨菲濃度的升高呈遞減趨勢(shì)，5μg/L和10μg/L濃度組CYP4蛋白表達(dá)量均與對(duì)照