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文檔簡介
1、背景及目的:
芬太尼為阿片類鎮(zhèn)痛藥物,鎮(zhèn)痛作用好,是嗎啡鎮(zhèn)痛作用的50-100倍,廣泛應(yīng)用于臨床麻醉以及癌癥病人的鎮(zhèn)痛治療中。臨床工作中發(fā)現(xiàn),不同患者使用同等劑量的芬太尼產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛效果和副作用明顯不同。芬太尼主要通過肝臟中CYP3A4酶進行代謝成為幾乎沒有活性的去甲基芬太尼,研究發(fā)現(xiàn),不同患者的CYP3A4酶活性差異性很大,而基因多態(tài)性是影響CYP3A4酶活性的主要因素。
近年來,人們研究發(fā)現(xiàn)一種小分子單鏈RNA(m
2、iRNA)可以作用于基因的轉(zhuǎn)錄后過程,影響蛋白的表達,在生命的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。肝臟組織中也發(fā)現(xiàn)了多種miRNA,但是這些miRNA有些是無功能的,有些是有功能的,需要進行相關(guān)實驗進行驗證。有研究指出Hsa-miR-660可能與CYP3A4酶活性存在相關(guān)性,但尚且沒有進行細胞水平的驗證。
本實驗主要研究肝細胞中Hsa-miR-660相對表達量對CYP3A4蛋白表達的影響。
材料與方法:
所用的細
3、胞為人正常肝細胞chang liver,將穩(wěn)定表達的chang liver細胞培養(yǎng)于37°5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)基為含10%胎牛血清RPMI1640,2-3天換一次培養(yǎng)基,保證細胞可以正常生長。在細胞生長良好時可準備病毒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前將細胞鋪于6孔板上,繼續(xù)進行細胞培養(yǎng),在細胞融合度達到80%以上時可進行轉(zhuǎn)染。實驗分為四組:分別為對照組(C)、miRNA過表達組(H)、miRNA沉默組(L)和陰性載體組(N)。C組加入等量的完全培養(yǎng)基
4、,L組加入包裹抑制Hsa-miR-660表達質(zhì)粒的慢病毒,H組加入包裹過表達Hsa-miR-660質(zhì)粒的慢病毒,N組加入包裹空載體的慢病毒進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時按MOI=50加入病毒后共同培養(yǎng),24小時后將含有病毒的培養(yǎng)基吸出,加入含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48-72h后進行在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后一部分細胞提取總RNA,實時熒光定量法進行測定CYP3A4 mRNA相對表達量和Hsa-miR-660相對表達量。內(nèi)參
5、分別為GAPDH和U6。剩余細胞繼續(xù)培養(yǎng),待細胞生長較為旺盛時提取總蛋白,western blot法測定CYP3A4的相對表達量,內(nèi)參為GAPDH。
結(jié)果:
1.轉(zhuǎn)染效率測定
熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,H組、L組、N組三組轉(zhuǎn)染效率均為50%-70%。
2.Hsa-miR-660相對表達量的測定
實時熒光定量PCR法測定四組Hsa-miR-660相對表達量,F(xiàn)=31.857,P〈0.05,
6、差異有統(tǒng)計學意義.N組與 C組相比,差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.564〉0.05).H組較C組Hsa-miR-660表達量顯著增加,L組較C組Hsa-miR-660表達量顯著降低。H組(8.372±0.403)較N組(4.847±0.511)Hsa-miR-660表達量顯著增加,L組(2.985±0.407)較N組(4.847±0.511)Hsa-miR-660表達量顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義。
3.CYP3A4 mRNA表
7、達量的測定
RT-PCR法測定四組CYP3A4 mRNA,四組mRNA的表達量不存在差異, F=0.381,P=0.768>0.05。
4.CYP3A4蛋白表達量的測定
western blot法測定四組CYP3A4蛋白相對表達量,四組之間CYP3A4蛋白的相對表達量存在統(tǒng)計學差異,F(xiàn)=20.225,P〈0.01。C組和N組之間差異沒有統(tǒng)計學意義(P〉0.05), H組較C組CYP3A4蛋白相對表達量顯著降
8、低,L組較C組CYP3A4蛋白相對表達量顯著升高;H組(0.00548±0.00186)較N組(0.01768±0.04633)CYP3A4蛋白相對表達量顯著降低, L組(0.04092±0.01112)較 N組(0.01768±0.04633)CYP3A4蛋白相對表達量顯著升高,差異均存在統(tǒng)計學意義( P〈0.01)。
結(jié)論:
1.Hsa-miR-660并不影響CYP3A4 mRNA的穩(wěn)定性。
2.細胞水
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