綿果薺、卷果澀薺CBF基因的克隆及分析.pdf

1、低溫逆境脅迫是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因子。當(dāng)植物處于低溫逆境脅迫時(shí),一系列與抗逆相關(guān)的基因被誘導(dǎo)表達(dá),而CBF(C-repeat binding factor)基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子就可以激活這一系列與抗逆相關(guān)的功能基因的表達(dá)。早春短命植物是一類在春季或夏初短時(shí)間里迅速完成生活周期的特殊生態(tài)類型的草本植物。早春短命植物在低溫條件下可正常萌發(fā)生長(zhǎng),其必定具備高效的抗冷機(jī)制。本研究以綿果薺[Lachnoloma lehmannii Bunge]

2、、卷果澀薺[Malcolmia scorpioides (Bunge) Boiss]和粗果庭薺[Alyssum dasycarpum Steph.ex Willd]三種早春短命植物為材料,對(duì)它們開展了抗冷性評(píng)價(jià),并進(jìn)行了綿果薺和卷果澀薺抗冷相關(guān)的CBF基因克隆,生物信息學(xué)分析、表達(dá)量分析及其原核表達(dá)載體構(gòu)建等研究,為進(jìn)一步研究CBF基因功能奠定基礎(chǔ),并為深入研究早春短命植物抗寒分子機(jī)理提供理論指導(dǎo)。
　　1、4℃條件下對(duì)三種早春短

3、命植物進(jìn)行不同時(shí)間的低溫處理,測(cè)定其7項(xiàng)生理生化指標(biāo),綜合評(píng)價(jià)三種植物的抗冷能力。結(jié)果表明,三種植物的抗冷能力從大到小依次為:卷果澀薺>綿果薺>粗果庭薺;單一生理生化指標(biāo)很難反映植物抗冷能力,相對(duì)電導(dǎo)率、游離脯氨酸含量、可溶性糖含量、SOD酶活性及POD酶活性能較好反映各材料的抗冷性大小,可作為早春短命植物抗冷性鑒定的綜合參考指標(biāo)。
　　2、通過同源克隆策略和RT-PCR技術(shù),克隆了綿果薺和卷果澀薺的CBF基因,并設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物對(duì)其

4、進(jìn)行驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果表明已成功獲得綿果薺、卷果澀薺的CBF基因,通過對(duì)拼接得到的cDNA和驗(yàn)證所得的DNA進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)CBF基因不含有內(nèi)含子。將克隆所得基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),獲得基因登錄號(hào),綿果薺CBF基因登錄號(hào)為JQ687132,卷果澀薺CBF基因登錄號(hào)為JQ687138。
　　3、用生物信息學(xué)方法分析、預(yù)測(cè)綿果薺CBF、卷果澀薺CBF基因的結(jié)構(gòu)及功能特點(diǎn)。綿果薺和卷果澀薺CBF基因及其編碼蛋白都具有CBF基因家族

5、成員共有的特征,初步判斷克隆所得的綿果薺和卷果澀薺CBF基因具有與其他植物CBF基因相似的功能,將綿果薺的CBF基因命名為L(zhǎng)lCBF基因,卷果澀薺的CBF基因命名為MsCBF基因。
　　4、使用熒光定量RT-PCR技術(shù),以Actin基因?yàn)閮?nèi)參對(duì)LlCBF基因、MsCBF基因的低溫誘導(dǎo)表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明,當(dāng)脅迫2h時(shí),MsCBF的表達(dá)量達(dá)到最大,與對(duì)照相比提高了近10倍。在低溫脅迫6h時(shí),根、莖、葉中的LlCBF基因表達(dá)量均達(dá)