菲油果花發(fā)育解剖觀測及相關(guān)基因的克隆.pdf

1、菲油果Feijoa sellowiana Berg.系桃金娘科、菲油果屬植物，是我國新近引進(jìn)的世界新興水果樹種，兼具食用、觀賞、綠化等用途，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高。本學(xué)位論文開展了開花相關(guān)生物學(xué)特性研究，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用前景。論文首次對菲油果花器官發(fā)育進(jìn)程進(jìn)行了解剖觀測、構(gòu)建了菲油果花蕾cDNA文庫和EST文庫，克隆了菲油果FsLFY基因和MADS-box(FsPI、FsSEP1)基因，并進(jìn)行了表達(dá)特征和生物信息學(xué)分析，獲得了一系列開創(chuàng)性的

2、研究結(jié)果，豐富了菲油果花發(fā)育的生物學(xué)理論，為進(jìn)一步研究菲油果開花調(diào)控和開發(fā)利用菲油果提供了重要的科學(xué)依據(jù)。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.菲油果花發(fā)育解剖學(xué)研究。菲油果的花芽分化可以劃分為6個(gè)時(shí)期：即未分化期、前分化期、萼片形成期、花瓣形成期、雌雄蕊形成期和子房花藥形成期。菲油果花藥為4室；花藥壁發(fā)育屬基本型；腺質(zhì)絨氈層；小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂中胞質(zhì)分裂為同時(shí)型，四分體排列多為正四面體；開花前2～3天花粉成熟，成熟花

3、粉為2-細(xì)胞型。大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂形成的4個(gè)大孢子呈直線排列，其中合點(diǎn)端的大孢子具功能，經(jīng)過3次有絲分裂后，于開花當(dāng)天形成成熟八核胚囊，胚囊發(fā)育屬蓼型。在發(fā)育過程中，雌雄配子體與花形態(tài)特征之間有著相對穩(wěn)定的關(guān)系。
　　 2.菲油果花器官cDNA文庫構(gòu)建。以6個(gè)不同發(fā)育階段的混合菲油果花蕾為材料，提取總RNA，分離純化mRNA，在SuperSciptTMⅡ RnaseH-ReverseTranscriptase等的作用下合成cD

4、NA，與pBluescriptⅡ SK(+)XR載體連接重組并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH10B，成功地構(gòu)建了菲油果花器官發(fā)育時(shí)期的高質(zhì)量cDNA文庫。經(jīng)檢測，cDNA文庫庫容量2.02×106克隆子，重組率高達(dá)92.32％，插入片段長度在600 bp-2000 bp，平均長度超過800 bp。該文庫的構(gòu)建為建立菲油果花器官EST文庫、開展基因分離鑒定、制作菲油果基因芯片和基因表達(dá)檢測等奠定了良好基礎(chǔ)。
　　 3.菲油果花器官EST文庫構(gòu)

5、建。對已構(gòu)建的cDNA文庫隨機(jī)挑取3500個(gè)克隆進(jìn)行5’端測序，獲得了高代表性的表達(dá)序列標(biāo)簽EST文庫。獲得原始序列2856個(gè)，測序成功率81.6％，獲得了2840條大于100 bp的高質(zhì)量EST序列，其中500bp-700 bp的EST序列2520條，占88.73％。對2840條有效ESTs進(jìn)行組裝拼接，共獲得1682個(gè)非重復(fù)序列，平均長度為698.76 bp，其中重疊群為438個(gè)，單拷貝ESTs為1244個(gè)。從1682條非重復(fù)序列中

6、預(yù)測得到1379個(gè)開放閱讀框，其中1244條單拷貝ESTs中包含1120個(gè)開放閱讀框，占總數(shù)的81.22％，438個(gè)重疊群有259個(gè)ORF，占18.78％。
　　 4.菲油果花器官EST生物信息學(xué)分析。1682條非重復(fù)序列在核苷酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性Blast，結(jié)果有637條能找到同源序列，占總數(shù)的49.53％，其中為推測功能基因的有367條；與非冗余核酸庫中Blast結(jié)果有851條非重復(fù)序列找到同源序列，占總數(shù)的66.17％，其

7、中612條序列為推測功能基因；與SWISSPROT蛋白庫Blast結(jié)果有547條序列找到同源序列，占總數(shù)的42.53％。將非重復(fù)序列與COG庫進(jìn)行Blast分析，獲到有注釋的序列236條，按功能分為18類。其中，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生，糖類轉(zhuǎn)運(yùn)與新陳代謝，轉(zhuǎn)譯后修飾與蛋白轉(zhuǎn)換、脂類轉(zhuǎn)運(yùn)與新陳代謝等4類中注釋的序列最多，數(shù)量分別為50、38、34、24，所占比例分別為21.19％、16.1％、14.41％、10.17％。
　　

8、 5.菲油果FsLFY基因的克隆與生物信息學(xué)分析。根據(jù)已知菲油果LFY基因588 bp EST序列信息，設(shè)計(jì)特異引物，分別通過5’RACE和3’RACE技術(shù)獲得了FsLFY基因的5’和3’末端序列，通過拼接，獲得FsLFY基因的全長cDNA克隆，再通過基因組PCR獲得了FsLFY基因的基因組序列，將FsLFY基因cDNA和基因組序列提交至GenBank，接受號(hào)為JN562738。菲油果FsLFY基因cDNA全長1336 bp，5’非轉(zhuǎn)錄

9、區(qū)91 bp和3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)174 bp，全部CDS1071bp，編碼356個(gè)氨基酸。FsLFY基因含2個(gè)內(nèi)含子，長度分別為63 bp、109 bp。FsLFY氨基酸序列含2個(gè)可變區(qū)和2個(gè)保守區(qū)。在DNA序列水平上，F(xiàn)sLFY基因與菊花ClLFY的相似性最低，為59.4％，與藍(lán)桉EglLFY的相似性最高，為94.4％；在氨基酸水平上，F(xiàn)sLFY基因與蘭花OiLFY基因的相似性最低，為60.3％，與藍(lán)桉EglLFY的相似性最高，為95.2％

10、。FsLFY蛋白預(yù)測分子量為40631.8Da，等電點(diǎn)為8.59，屬于較不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。FsLFY蛋白疏水指數(shù)從-3.933到1.456，整個(gè)蛋白質(zhì)基本上是表現(xiàn)出親水性。FsLFY蛋白不含信號(hào)肽，含31個(gè)α螺旋，30個(gè)β折疊鏈和34個(gè)卷曲。
　　 6.菲油果FsPI基因的cDNA克隆與生物信息學(xué)分析。根據(jù)已知菲油果PI基因626 bp的EST序列信息，設(shè)計(jì)特異引物，分別通過5’RACE和3’RACE技術(shù)獲得了FsLFY基因的5’和

11、3’末端序列，通過拼接，獲得FsPI基因的全長cDNA克隆，將其提交至GenBank，接受號(hào)為JN562739。菲油果FsPI的cDNA全長891bp，獲得了部分5’非轉(zhuǎn)錄區(qū)6 bp和完整的3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)258 bp，全部CDS為627bp，編碼208個(gè)氨基酸。菲油果FsPI基因具有MADS-box B類PI基因的典型特征，含MADS結(jié)構(gòu)域、K結(jié)構(gòu)域以及PI結(jié)構(gòu)域。在DNA序列水平上，菲油果FsPI與長春花CrGLO1的相似性最低，為66

12、.7％，與白干層MqPI的相似性最高，為93.0％；在氨基酸水平上，與辣椒CaPI基因的相似性最低，為62.0％，與白千層MqPI基因相似性最高，為91.8％。菲油果FsPI蛋白預(yù)測分子量為24286.4Da，等電點(diǎn)為8.83，是一種弱堿性較不穩(wěn)定蛋白。菲油果FsPI蛋白疏水指數(shù)位于-2.956到1.933之間，整個(gè)蛋白質(zhì)基本上表現(xiàn)出親水性。菲油果FsPI不含信號(hào)肽，屬于非分泌性蛋白，其含25個(gè)α螺旋，21個(gè)β折疊鏈和20個(gè)卷曲。

13、>　　 7.菲油果FsSEP1基因的cDNA克隆與生物信息學(xué)分析。根據(jù)已知菲油果SEP1基因338 bp的EST序列信息，設(shè)計(jì)特異引物，分別通過5’RACE和3’RACE技術(shù)獲得了FsSEP1基因的5’和3’末端序列，通過拼接，獲得FsSEP1基因的全長cDNA克隆，將其提交至GenBank，接受號(hào)為JN562740。菲油果FsSEP1的cDNA全長1120 bp，5’非轉(zhuǎn)錄區(qū)83 bp和3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)299 bp，全部CDS為738

14、bp，編碼245個(gè)氨基酸。菲油果FsSEP1基因具有MADS-box E類SEP基因的典型特征，含MADS結(jié)構(gòu)域、K結(jié)構(gòu)域和SEP結(jié)構(gòu)域。在DNA和氨基酸序列水平上，菲油果FsSEP1基因都是與擬南芥.AthSEP1的相似性最低，分別為69.1％，66.7％，，與巨桉EgM3的相似性最高，為92.4％，為91.4％。菲油果FsSEP1蛋白預(yù)測分子量為28009.8 Da，等電點(diǎn)為8.80，是一種弱堿性蛋白，屬于較不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。菲油果Fs

15、SEP1蛋白的疏水指數(shù)從-2.411到2.089，整個(gè)蛋白質(zhì)基本上表現(xiàn)出親水性。菲油果FsSEP1不含信號(hào)肽，屬于非分泌性蛋白，其含23個(gè)α螺旋，25個(gè)β折疊鏈和26個(gè)卷曲。
　　 8.菲油果FsLFY基因的表達(dá)模式。通過RT-PCR擴(kuò)增出菲油果鈣調(diào)素基因Fscalm，以此為內(nèi)參基因。半定量RT-PCR檢測結(jié)果表明，菲油果FsLFY基因在生殖器官和營養(yǎng)器官中均有表達(dá)。總體上在整個(gè)花蕾發(fā)育期間的表達(dá)強(qiáng)烈，表達(dá)量要明顯高于結(jié)果枝、營