敲降clock1a對(duì)斑馬魚(yú)per基因表達(dá)和運(yùn)動(dòng)行為節(jié)律的影響.pdf

1、在自然界中，無(wú)論從低等的細(xì)菌還是到高等動(dòng)物甚至人類，都存在近似24小時(shí)的晝夜節(jié)律，稱為生物鐘。生物鐘對(duì)如體溫變化、睡眠周期、肝臟代謝及激素分泌等多種基本的生理過(guò)程都具有調(diào)控作用。生物鐘紊亂會(huì)導(dǎo)致一系列疾病，例如睡眠障礙、代謝失調(diào)、提前衰老及各種心理疾病等。因此揭示生物鐘的分子機(jī)制及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)解釋正常生理生化行為及生物鐘紊亂所引發(fā)的相關(guān)疾病的防治有十分重要的意義。
　　生物鐘的分子機(jī)制主要是存在一個(gè)細(xì)胞自主調(diào)控的轉(zhuǎn)錄翻譯反饋環(huán)路

2、。該環(huán)路中存在一對(duì)正向調(diào)節(jié)因子：CLOCK和BMAL，兩者結(jié)合形成異二聚體，通過(guò)結(jié)合到負(fù)向調(diào)節(jié)因子per和cry啟動(dòng)子的E/E’-box元件來(lái)激活其轉(zhuǎn)錄。隨后，PER蛋白和CRY蛋白結(jié)合形成復(fù)合體并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，作用于CLOCK:BMAL異二聚體，從而反饋抑制自身轉(zhuǎn)錄。
　　clock基因是第一個(gè)通過(guò)大規(guī)模突變體篩選獲得的脊椎動(dòng)物生物鐘基因，其蛋白屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）-PAS轉(zhuǎn)錄因子家族，包含三個(gè)功能域，bHLH域，

3、主要作用是DNA結(jié)合和蛋白二聚化；PAS域，是一個(gè)蛋白相互作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)構(gòu)域和位于C端的谷氨酰胺富含域，主要作用是轉(zhuǎn)錄激活。
　　顯性失活技術(shù)是一種常見(jiàn)的基因敲降技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)擬利用顯性失活原理在斑馬魚(yú)體內(nèi)過(guò)表達(dá)顯性失活突變Clock1a蛋白，該蛋白僅包含bHLH和PAS域而缺失C端的轉(zhuǎn)錄激活域，該突變蛋白能與正常Clock1a蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Bmal蛋白，從而使內(nèi)源Clock1a蛋白下調(diào)，影響整個(gè)生物鐘反饋環(huán)路?；诖嗽砦覀儤?gòu)

4、建并獲得了斑馬魚(yú)clock1a顯性失活轉(zhuǎn)基因系。
　　通過(guò)熒光定量PCR法，我們確定了斑馬魚(yú)clock1a顯性失活轉(zhuǎn)基因系陽(yáng)性F0代的外源片段拷貝數(shù)。通過(guò)原位雜交技術(shù)及熒光定量 PCR技術(shù)，證明 clock1a顯性失活片段在轉(zhuǎn)基因系體內(nèi)高表達(dá)，而正常clock1a的表達(dá)水平并未受到影響。對(duì)下游per基因表達(dá)情況的檢測(cè)結(jié)果顯示，per基因在轉(zhuǎn)基因系中表達(dá)量明顯下調(diào)，證明在斑馬魚(yú)中4個(gè)per的表達(dá)受clock1a調(diào)控。行為學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，

5、在正常光暗條件下，轉(zhuǎn)基因系活動(dòng)量高于野生型；恒暗條件下，相較于野生型，轉(zhuǎn)基因系運(yùn)動(dòng)節(jié)律相位有前移現(xiàn)象，提示clock1a敲降可能導(dǎo)致了類似人類躁狂癥的行為。
　　本研究成功構(gòu)建了clock1a顯性失活轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，初步探究了內(nèi)源clock1a競(jìng)爭(zhēng)性活性下調(diào)對(duì)斑馬魚(yú)per基因的表達(dá)和行為節(jié)律的影響。
　　同時(shí)本研究利用TALEN技術(shù)，建立了可遺傳的clock1a斑馬魚(yú)突變體。為進(jìn)一步研究clock1a的作用機(jī)制及其對(duì)下游生理過(guò)