固定化雙酶法定向合成右旋糖酐及其調(diào)控機(jī)理研究.pdf

1、右旋糖酐(Dextran，Dex)是蔗糖經(jīng)腸膜明串珠菌發(fā)酵所得產(chǎn)物，作為天然多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，是多糖研究的熱門糖類之一，其性質(zhì)和用途與其分子量大小、分子量分布及其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。小分子量的右旋糖酐中，分子量在104～105 Da范圍內(nèi)的右旋糖酐具有擴(kuò)增血容量、抗凝血、降低血液粘度的作用;而分子量小于104 Da的右旋糖酐可用來合成右旋糖酐鐵及其他右旋糖酐衍生物用于臨床，也可作為益生元用于保健品生產(chǎn)，是目前附加值最高、應(yīng)用最廣的分子

2、量片段。但是，現(xiàn)有的生產(chǎn)方法（先發(fā)酵再水解）生產(chǎn)的右旋糖酐分子量在分布較廣，小分子量的右旋糖酐的含量較少，且產(chǎn)物中雜質(zhì)較多，質(zhì)量較差，需再經(jīng)過一系列的分離純化處理，處理過程中需耗用大量的酸和有機(jī)溶劑。因此，建立一種操作簡單、成本低廉、綠色環(huán)保的方法，制備特定分子量的右旋糖酐，對提高右旋糖酐的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展及推廣應(yīng)用具有重要意義。
　　固定化酶制備右旋糖酐具有產(chǎn)物易分離、酶制劑可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)。本課題利用固定化右旋糖酐蔗糖酶（dextr

3、ansucrase，合成酶，DS）和固定化右旋糖酐酶(dextranase，分解酶，DN)，同時(shí)加入蔗糖溶液中，通過控制底物（蔗糖）的濃度、固定化合成酶DS和分解酶DN的加入量，調(diào)控產(chǎn)物右旋糖酐的分子量及分子量分布，并對固定化雙酶法定向合成右旋糖酐的規(guī)律進(jìn)行了探索，以及動(dòng)力學(xué)分析與建模。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)通過正交試驗(yàn)，驗(yàn)證固定化雙酶法定向合成右旋糖酐的可行性，并初步篩選出定向合成目標(biāo)分子量(Mw＜105 Da)片

4、段的右旋糖酐的反應(yīng)條件。當(dāng)體系內(nèi)雙酶酶活力比、DS酶量和蔗糖濃度不同時(shí)，產(chǎn)物的平均分子量、均一度及各分子量片段所占百分比是不同的。與課題組前期研究單右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖生產(chǎn)右旋糖酐的結(jié)果相比較，固定化雙酶體系中右旋糖酐的分子量分布更接近于小分子量的分布范圍內(nèi)，分子量處于Mw＜105 Da范圍的右旋糖酐比例顯著增加。說明用固定化雙酶法來定向合成特定分子量的右旋糖酐是可行的。初步篩選的定向合成分子量范圍Mw＜105 Da的右旋糖酐的反應(yīng)條

5、件為:雙酶酶酶活力比(DN∶DS)為1∶8、DS加入量為0.4 U/mL、底物濃度為0.2 M。
　　(2)對底物濃度、DS加入量和雙酶酶活力比三個(gè)因素對底物蔗糖的轉(zhuǎn)化率、右旋糖酐產(chǎn)量和目標(biāo)分子量(Mw＜105 Da)片段所占百分比的影響規(guī)律進(jìn)行了探索。當(dāng)體系中合成酶DS加入量和雙酶酶活力比(DN∶DS)分別為0.4 U/mL和1∶8時(shí)，隨蔗糖濃度的增大蔗糖轉(zhuǎn)化率先增加后減少，右旋糖酐產(chǎn)量增大，目標(biāo)分子量(Mw＜105 Da)的右

6、旋糖酐所占總右旋糖酐百分比先增加后降低。當(dāng)體系中底物（蔗糖）濃度為0.2 M，雙酶酶活力比(DN∶DS)為1∶8時(shí)，隨合成酶DS加入量的增加蔗糖轉(zhuǎn)化率升高，右旋糖酐產(chǎn)量呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢，目標(biāo)分子量(Mw＜105 Da)片段的右旋糖酐所占百分比，總體上呈減少趨勢，但在0.3 U/mL和0.5 U/mL處有小幅波動(dòng)。當(dāng)體系中底物濃度為0.2 M，DS加入量為0.4 U/mL時(shí)，隨雙酶酶活力比(DN∶DS)的增大蔗糖轉(zhuǎn)化率減小，右旋糖酐產(chǎn)量

7、先減少后增加，分子量小于105 Da的右旋糖酐的百分比增大。
　　(3)在固定化雙酶法定向合成右旋糖酐的基礎(chǔ)上，對蔗糖消耗速率、右旋糖酐生成量和目標(biāo)分子量(Mw＜105 Da)片段右旋糖酐所占百分比進(jìn)行了數(shù)學(xué)分析，并建立了相關(guān)數(shù)學(xué)模型和表達(dá)式。
　　蔗糖消耗速率符合一級(jí)反應(yīng)，反應(yīng)速率與蔗糖濃度的一次方成正比，且速率常數(shù)根據(jù)雙酶酶活力比的變化而不同，說明反應(yīng)速率與雙酶的單位酶活力有關(guān)。
　　在雙酶酶活力比(DN∶DS)1