右旋糖酐定量檢測試劑盒的研制及其初步應(yīng)用.pdf

1、右旋糖酐(Dextran)，又名葡聚糖，由Leuconostoc mesenteroides等微生物產(chǎn)生的酶聚合葡萄糖而成或葡萄糖通過化學(xué)聚合而成。右旋糖酐廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用主要包括:作為血漿體積擴張劑，作為抗凝劑，以及作為滲透壓調(diào)節(jié)劑用于相關(guān)的疾病治療。一般機體組織細胞并不能直接利用右旋糖酐，主要從尿液排出，右旋糖酐使用過量會引起急性腎衰竭、充血性心衰竭、肺水腫及血小板減少等毒副作用。因此，監(jiān)測血液、尿

2、液的右旋糖酐含量是指導(dǎo)右旋糖酐用量的重要指標，同時右旋糖酐也是診斷血液或尿道微生物感染的依據(jù)，另外右旋糖酐的定量監(jiān)測也是食品工業(yè)質(zhì)控的一個重要指標與技術(shù)。本論文研究利用抗右旋糖酐單克隆抗體建立簡便、快速的右旋糖酐競爭ELISA定量檢測試劑盒。
　　首先，利用右旋糖酐與BSA交聯(lián)物作為免疫原，免疫4～6周齡雌性BALB/c小鼠，通過細胞融合技術(shù)篩選獲得3株（命名為D9，D24，D27）穩(wěn)定分泌抗右旋糖酐單克隆抗體雜交瘤細胞株。腹腔注

3、射D24雜交瘤細胞制備腹水，經(jīng)rProtein A親和柱純化得到了純度較高的抗體（抗體純度約為95％，濃度約為2 mg/mL）;間接ELISA結(jié)果表明抗體效價達到2.5×10-5，表明抗體具有較高的特異性和親和力。
　　其次，利用抗右旋糖酐單克隆抗體建立右旋糖酐競爭ELISA定量檢測方法，確定檢測體系優(yōu)化條件:(1)抗原包被濃度為1.25 tg/mL;(2)包被時間為4℃過夜;(3)封閉液為2％ BSA;(4)右旋糖酐單克隆抗體稀

4、釋度為1:8000;(5)競爭反應(yīng)時間為37℃，1 h;(6)底物作用時間為10 min。該優(yōu)化檢測體系對dextran2000標準品在濃度19.53 ng/mL～1250 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.9964;體系最低檢測限為9.6 ng/mL;標準品回收率在90.7％～115.6％之間;批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于15％，表明該檢測方法具有良好的靈敏度和較高的準確性。
　　最后，利用建立的定量檢測方法測定臨床樣

5、品，結(jié)果表明，45份人血清和尿液樣品中，29份未檢出右旋糖酐(＜9.6 ng/mL);有16份可檢出右旋糖酐（范圍:10.0±1.2 ng/mL～22.2±2.8 ng/mL），其中有2份尿液樣品出現(xiàn)較高濃度右旋糖酐，比一般尿液右旋糖酐檢出均值(14.3 ng/mL)高5倍以上，提示這兩份樣品可能受到微生物的感染，與臨床診斷尿路感染相符。競爭ELISA測定的結(jié)果與雙抗體夾心ELISA法測定的結(jié)果相似，進一步證實競爭ELISA在臨床上測定