酶法耦合兩級(jí)膜定向制備右旋糖酐及其機(jī)理研究.pdf

1、右旋糖酐是蔗糖經(jīng)右旋糖酐蔗糖酶催化聚合成的一種天然微生物活性多糖，不同分子量及結(jié)構(gòu)的右旋糖酐被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及化工等領(lǐng)域中。重均分子量(Mw)為104 Da～105 Da的右旋糖酐可作為代血漿，具有擴(kuò)增血容量、降低血液黏度及抗凝血等功能。小分子量右旋糖酐(Mw＜104Da)可作為高附加值的益生元，添加到保健品中。傳統(tǒng)上，采用的“菌種發(fā)酵-酸水解-乙醇分級(jí)沉淀”制備特定分子量藥用右旋糖酐的方法存在操作繁雜、產(chǎn)品質(zhì)量較差且容易引發(fā)臨床

2、副反應(yīng)等諸多可以改善的地方。
　　酶法耦合兩級(jí)膜制備右旋糖酐具有提高產(chǎn)物均一性、簡(jiǎn)化下游產(chǎn)物分離純化等優(yōu)點(diǎn)。本課題通過單酶法（右旋糖酐蔗糖酶）耦合兩級(jí)膜探索右旋糖酐的聚合機(jī)理;雙酶法（右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶）耦合兩級(jí)膜實(shí)現(xiàn)對(duì)特定分子量及分布的右旋糖酐的調(diào)控與定向制備。主要的研究?jī)?nèi)容和結(jié)果摘要如下:
　　(1)建立HPGFC雙柱串聯(lián)法跟蹤檢測(cè)產(chǎn)物右旋糖酐分子量、定量檢測(cè)蔗糖消耗量、葡萄糖和果糖量的變化。通過對(duì)比KS-801

3、、KS-805單柱及雙柱串聯(lián)條件下對(duì)系列右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品的分離效果，初步確定了KS-801和KS-805雙柱串聯(lián)檢測(cè)的有效性;此外，對(duì)比單柱及雙柱條件下發(fā)酵產(chǎn)物的色譜圖發(fā)現(xiàn)，雙柱串聯(lián)不僅能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)各個(gè)分子量片段右旋糖酐的檢測(cè)，而且可以有效地分離、鑒定和定量檢測(cè)發(fā)酵液中的蔗糖、葡萄糖和果糖。
　　(2)探究了單酶法耦合兩級(jí)膜條件下右旋糖酐蔗糖酶催化合成產(chǎn)物右旋糖酐的機(jī)理，并且研究了不同蔗糖底物濃度及右旋糖酐蔗糖酶添加量對(duì)產(chǎn)物右旋糖酐分

4、子量、產(chǎn)量、得率及蔗糖轉(zhuǎn)化率的影響。通過跟蹤檢測(cè)不同蔗糖濃度和右旋糖酐蔗糖酶添加量條件下，一級(jí)膜和二級(jí)膜料液桶中右旋糖酐分子量的變化，間接的證實(shí)了右旋糖酐的聚合機(jī)理有可能是右旋糖酐分子鏈在右旋糖酐蔗糖酶活性位點(diǎn)上不斷聚合葡萄糖基，直至達(dá)到一定的分子量(Mw＞106 Da)才脫落，而不是一個(gè)從小到大，慢慢聚合，不斷脫落的過程。在兩級(jí)膜的干預(yù)下，右旋糖酐分子量同蔗糖底物濃度和右旋糖酐蔗糖酶添加量呈正相關(guān)關(guān)系;蔗糖轉(zhuǎn)化率反比于蔗糖底物濃度，正

5、比于右旋糖酐蔗糖酶添加量;右旋糖酐產(chǎn)量正比于蔗糖底物濃度和右旋糖酐蔗糖酶添加量。
　　(3)在單酶法耦合兩級(jí)膜的基礎(chǔ)上引入右旋糖酐酶構(gòu)建雙酶法耦合兩級(jí)膜反應(yīng)體系對(duì)右旋糖酐分子量進(jìn)行調(diào)控。在雙酶酶活比（右旋糖酐蔗糖酶:右旋糖酐酶）為10∶1，底物濃度為0.8 M、右旋糖酐蔗糖酶添加量為0.2 U/mL時(shí)，二級(jí)膜料液桶中目標(biāo)分子量片段右旋糖酐(104 Da＜Mw＜105 Da)所占比例達(dá)到68.71％。兩級(jí)膜的作用使得二級(jí)膜料液桶中右