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
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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
觀察在平面誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下,周期性等軸牽張應(yīng)變刺激對(duì)小鼠BMSCs成軟骨分化早期的影響,探討周期性等軸牽張應(yīng)變刺激在干細(xì)胞成軟骨分化過(guò)程早期的機(jī)制。
方法:
提取并分離昆明小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后,換液、傳代培養(yǎng)至第3代,然后進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定及三系分化誘導(dǎo)。以2×105/孔的細(xì)胞量種植于BioFlex生物培養(yǎng)板。按不同處理因素將實(shí)驗(yàn)分為2組:A組(非誘導(dǎo)組):普通培養(yǎng)液培養(yǎng)8天,并分別給與0、1、3、5
2、、7天的力學(xué)加載;B組(誘導(dǎo)組):使用成軟骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)8天,并分別給與0、1、3、5、7天的力學(xué)加載。實(shí)驗(yàn)采用美國(guó)Flexcell-5000力學(xué)加載系統(tǒng),設(shè)置參數(shù)為正弦波0~1%Elong、1Hz、4h/D進(jìn)行牽張刺激,并于2、4、6、8天換液。于培養(yǎng)第8日提取各組細(xì)胞,用CCK-8法檢測(cè)各組的增殖率;通過(guò)RT-PCR分析SOX9、Col-Ⅱ及ROCK1的基因表達(dá)。Elisa法測(cè)定最后一日各組糖胺聚糖含量;番紅O染色及阿爾新蘭染色觀測(cè)各
3、組細(xì)胞周基質(zhì)。
結(jié)果:
1.原代細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后可觀察到部分貼壁生長(zhǎng),形狀呈類圓形、多邊形,傳代后細(xì)胞呈魚(yú)群狀生長(zhǎng),形成細(xì)胞集落。通過(guò)流式細(xì)胞儀鑒定,細(xì)胞表面CD45、Sca-1表達(dá)率小于3%,CD11b, CD44表達(dá)率大于95%,表明所分離的細(xì)胞幾乎均為間充質(zhì)干細(xì)胞,且均一性好。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行三系分化誘導(dǎo)后染色,證實(shí)細(xì)胞可以分化為骨、軟骨、脂肪細(xì)胞。
2.細(xì)胞增殖率檢測(cè):隨加載時(shí)間延長(zhǎng),A、B兩組增值率均
4、逐漸升高,在加載0天,B組增殖率較A組明顯下降,然而隨加載時(shí)間延長(zhǎng),B組增值率逐漸接近A組。
3.RT-PCR檢測(cè):相關(guān)因素處理8天后, B組中SOX9、Col-Ⅱ、ROCK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均較A組增高(P<0.05);在A組內(nèi),SOX9未見(jiàn)明顯變化(P>0.05),Col-Ⅱ隨加載時(shí)間的延長(zhǎng),表達(dá)量逐漸增加,ROCK1隨著加載時(shí)間的延長(zhǎng),其表達(dá)量逐漸下降;在B組內(nèi)隨著加載時(shí)間的增加,SOX9、Col-Ⅱ相對(duì)表達(dá)量隨加載
5、時(shí)間延長(zhǎng),均逐漸增加,而ROCK1相對(duì)表達(dá)量則逐漸下降。
4.通過(guò)對(duì)最后一次換掉的培養(yǎng)基做糖胺聚糖濃度的Elisa檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)A組內(nèi)有減少趨勢(shì),但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);B組內(nèi)糖胺多糖的分泌量逐漸增加;且B組糖胺聚糖分泌量均較A組均增加(P<0.05)。
5.番紅O及阿爾新蘭染色顯示,A、B兩組均有成軟骨分化趨勢(shì),形狀隨時(shí)間加載均逐漸變長(zhǎng),B組變化均較A組明顯;A、B組內(nèi)PCM、Col-Ⅱ、GAG含量隨力學(xué)
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