氧濃度對大鼠脂肪干細胞(ADSCs)向軟骨細胞分化影響的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 探討5％、10％、20％三組不同的氧濃度對大鼠脂肪組織來源的干細胞(ADSCs)向軟骨細胞分化程度的影響。
　　 方法:
　　 原代提取Wistar大鼠的腹股溝及睪丸附近的脂肪組織,剪耿附睪脂肪墊,PBS沖洗3-4次,剔除血管和筋膜,消化約50-60min后,濾網濾過,離心10min,接種至50mL培養(yǎng)瓶中,放入正常CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),定期換液、傳代,觀察細胞形態(tài)。記錄細胞在不同時期的增值數目并繪制

2、成細胞生長曲線,觀察細胞不同時期的增值情況。將第3代脂肪干細胞以1×105/mL細胞密度接種于24孔培養(yǎng)板內的無菌蓋玻片上,放于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),定期換液,待細胞爬片滿80％時,分別向其中2孔內滴加CD29、CD44兔抗大鼠多克隆抗體(1:100)300μL,4℃孵育過夜,后加入二抗,在熒光顯微鏡下觀察細胞表面標志物并照像。脂肪干細胞向軟骨方向定向誘導:取第3代生長良好的脂肪干細胞調整細胞密度為1×106/ml分別放入5％、10％、2

3、0％三組不同氧濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并定期傳代。MTT比色法測定細胞活性:不同培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、7、14天后以1×105/mL細胞密度接種于96孔培養(yǎng)板內,在酶聯免疫檢測儀上選擇490 nm波長比色。免疫組化檢測Ⅱ型膠表達:分別取5％、10％低氧培養(yǎng)箱和CO2培養(yǎng)箱中誘導14 d后的細胞爬片,加入一抗、二抗,顯微鏡觀察細胞漿內情況。
　　 結果:
　　 成功的分離Wistar大鼠的腹股溝及睪丸附近脂肪組織,采用不同的培養(yǎng)箱培養(yǎng)

4、并誘導脂肪干細胞向軟骨細胞分化;細胞生長曲線反應細胞生長的速度及生長的平臺期;免疫熒光的方法鑒定細胞表面標志CD44、CD29陽性表達;將第三代細胞分別放入5％、10％、20％三種氧濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天觀察三組細胞的Ⅱ型膠原的表達情況,采用spssl8.0對Ⅱ型膠原的灰度值數據進行分析,三組數據間比較均有統(tǒng)計學意義,同時5％氧濃度組最明顯;MTT檢測5％氧濃度細胞的增殖明顯(P＜0.01)。
　　 結論:
　　 本試

5、驗研究討論從Wistar大鼠腹股溝及睪丸的脂肪組織中可提取出脂肪干細胞,在不同的培養(yǎng)條件下誘導分化,最終分化成軟骨細胞;5％氧濃度及10％氧濃度組的Ⅱ型膠原的灰度值與20％氧濃度組比較有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);MTT法測出5％氧濃度及10％氧濃度組細胞比20％氧濃度組增殖明顯,該實驗證明了低氧濃度的培養(yǎng)條件能夠促進脂肪干細胞增殖分化為軟骨細胞。為組織工程提供了重要的種子細胞,同時也為軟組織的修復提供了細胞的來源。為軟骨修復的組織工程