丹參酮ⅡA磺酸鈉誘導(dǎo)乳兔BMSCs向軟骨細(xì)胞分化中的作用及細(xì)胞密度對(duì)誘導(dǎo)的影響.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 乳兔BMSCs和軟骨細(xì)胞提取、生物學(xué)性質(zhì)觀察及丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)兩種細(xì)胞體外擴(kuò)增的影響
　　背景：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)功能是造血和細(xì)胞功能支持，該細(xì)胞的數(shù)量是隨著年齡增大而降低的;呈典型的長(zhǎng)梭形，漩渦狀生長(zhǎng)，具有很強(qiáng)的分化潛能;軟骨細(xì)胞(Chondrocyte)是軟骨組織的唯一細(xì)胞種類。軟骨細(xì)胞生成和維持軟骨基質(zhì)（主要包括膠原和蛋白聚糖）。針對(duì)人類軟骨損傷修復(fù)，仍然亟

2、待解決，其生長(zhǎng)單層性質(zhì)和環(huán)境要求導(dǎo)致不能單純擴(kuò)增解決修復(fù)。細(xì)胞組織工程應(yīng)用在這方面逐漸廣泛。
　　目的：分離乳兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞并傳代培養(yǎng)、利用多種檢測(cè)方法觀察其生物學(xué)性狀。研究丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)乳兔BMSCs和軟骨細(xì)胞的體外擴(kuò)增的作用;驗(yàn)證其對(duì)兩種細(xì)胞的體外擴(kuò)增作用及尋找出均促進(jìn)兩種細(xì)胞增長(zhǎng)進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的最佳藥物濃度。
　　方法：選用全骨髓貼壁分離法進(jìn)行乳兔骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的分離;二步酶消化法乳兔膝關(guān)節(jié)軟骨取

3、材獲取軟骨細(xì)胞。在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生物學(xué)形狀和相關(guān)檢測(cè)進(jìn)行鑒定;等比稀釋法配制15種不同濃度的丹參酮ⅡA磺酸鈉溶液，分別單獨(dú)培養(yǎng)乳兔BMSCs和軟骨細(xì)胞以及兩種細(xì)胞以1∶1比例混合細(xì)胞群，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;探索最佳藥物濃度。
　　結(jié)果：乳兔BMSCs和軟骨細(xì)胞形態(tài)觀察分別長(zhǎng)梭形和短梭形，相關(guān)檢測(cè)均鑒定為目的細(xì)胞，且丹參酮ⅡA磺酸鈉培養(yǎng)1∶1比例混合細(xì)胞時(shí)呈現(xiàn)增長(zhǎng)，最佳濃度是50ug/ml，而單獨(dú)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)在區(qū)間37.5u

4、g/ml至62.5ug/ml，因此50ug/ml作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究的最佳培養(yǎng)濃度。
　　結(jié)論：乳兔BMSCs和軟骨細(xì)胞提取選擇全骨髓貼壁法和二步酶消化法可行;丹參酮ⅡA磺酸鈉最佳實(shí)驗(yàn)濃度應(yīng)為50ug/ml。
　　第二部分 丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)乳兔BMSCs向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化作用的研究
　　目的：研究丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)乳兔BMSCs向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化作用。
　　方法：設(shè)立只更換培養(yǎng)基的正常乳兔BMSCs陰性對(duì)照組、最

5、佳丹參酮ⅡA磺酸鈉濃度的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組和加TGF-β1軟骨誘導(dǎo)體系的陽(yáng)性對(duì)照組;12孔板作培養(yǎng)板，孔底置爬片，誘導(dǎo)7天、14天、21天后分別取出爬片進(jìn)行番紅O染色、甲苯胺藍(lán)染色、Ⅱ型膠原免疫組化染色、FDA/PI熒光等檢測(cè)和利用RT-PCR定量檢測(cè)蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)量，驗(yàn)證丹參酮ⅡA磺酸鈉在乳兔乳兔BMSCs向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化作用的大小。
　　結(jié)果：陰性對(duì)照組的乳兔BMSCs未發(fā)生性狀的明顯改變，各種檢測(cè)均未呈陽(yáng)性表現(xiàn);實(shí)驗(yàn)

6、組和TGF-β1軟骨誘導(dǎo)體系組均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)變化，逐漸由長(zhǎng)梭形變?yōu)槎趟笮位蚨噙呅?，各種檢測(cè)均為陽(yáng)性表現(xiàn)，且在誘導(dǎo)過(guò)程中，時(shí)間越長(zhǎng)，乳兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞量最多，但TGF-β1軟骨誘導(dǎo)體系組明顯多于實(shí)驗(yàn)組，RT-PCR檢測(cè)顯示在實(shí)驗(yàn)組和TGF-β1軟骨誘導(dǎo)體系組均有蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組低于TGF-β1軟骨誘導(dǎo)體系組。
　　結(jié)論:丹參酮ⅡA磺酸鈉能促進(jìn)乳兔BMSCs向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化。
　　第三部分 細(xì)

7、胞種板密度對(duì)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化作用影響的研究
　　目的：研究細(xì)胞種板密度對(duì)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化作用影響。
　　方法：分別對(duì)12孔板種不同密度的乳兔BMSCs，分為三組，低密度組，中密度組和高密度組;均使用TGF-β1軟骨誘導(dǎo)體系進(jìn)行誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，定期更換培養(yǎng)液，誘導(dǎo)14天后進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察、Ⅱ型膠原免疫組化染色、FDA/PI熒光顯影和RT-PCR等檢測(cè)，驗(yàn)證細(xì)胞密度對(duì)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化過(guò)程的影響。
　　結(jié)果：三組誘導(dǎo)14天后均有明顯的間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變