轉(zhuǎn)fat-1基因體細(xì)胞克隆綿羊的研究.pdf

1、fat-1基因編碼ω-3 PUFAs脫氫酶，可以將PUFAs從ω-6轉(zhuǎn)化為ω-3形式。本研究目的是通過動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)將fat-1轉(zhuǎn)入綿羊的基因組，再利用動(dòng)物克隆技術(shù)創(chuàng)造能產(chǎn)生ω-3 PUFAs的轉(zhuǎn)基因綿羊，從而培育含ω-3 PUFAs豐富的轉(zhuǎn)基因肉羊新材料。以我區(qū)綿羊?yàn)閷?duì)象，摸索了綿羊克隆胚的構(gòu)建和胚胎移植體系；建立雄性綿羊胎兒的皮膚成纖維細(xì)胞系；克隆了秀麗隱桿線蟲的fat-1基因，構(gòu)建目的基因表達(dá)載體；再將其轉(zhuǎn)染到綿羊成纖維細(xì)胞基因組

2、中，經(jīng)G418篩選，PCR鑒定后選擇陽性細(xì)胞建立轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；通過體細(xì)胞克隆動(dòng)物技術(shù)構(gòu)建并生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆胚并移植，待移植后代出生后鑒定并檢測(cè)其肌肉中ω-6和ω-3 PUFAs的相對(duì)含量及比值；以獲得轉(zhuǎn)基因的具有保健功能的肉羊新品種。
　　1.綿羊體細(xì)胞克隆體系的優(yōu)化
　　本實(shí)驗(yàn)主要是對(duì)體細(xì)胞克隆胚移植胚齡的摸索。采用組織塊種植法分離培養(yǎng)了三種雌性成年綿羊耳皮膚成纖維細(xì)胞系，分三個(gè)階段進(jìn)行綿羊體細(xì)胞克隆體系的優(yōu)化。
　　

3、第一階段構(gòu)建了來源于1號(hào)細(xì)胞的重構(gòu)胚272枚，體外發(fā)育到桑椹胚期移植入17只受體羊中，有一只妊娠，妊娠率為5.88％，產(chǎn)羔羊1只，經(jīng)鑒定為克隆羊。
　　第二階段構(gòu)建了來源于2號(hào)細(xì)胞的重構(gòu)胚683枚，分別在胚胎發(fā)育的不同時(shí)期進(jìn)行了胚胎移植，共移植了35只受體羊。結(jié)果顯示，在3只移入的胚齡是1-細(xì)胞期胚胎的羊中，有一只妊娠并產(chǎn)羔1只，經(jīng)鑒定為克隆羊。
　　第三階段構(gòu)建了來源于3號(hào)細(xì)胞的重構(gòu)胚197枚，在1-細(xì)胞期階段全部移入了1

4、1只受體羊中，結(jié)果有兩只羊妊娠，妊娠率為18.18%，生產(chǎn)了3只克隆羊，產(chǎn)羔率為27.27%。有效地的重復(fù)了第二階段實(shí)驗(yàn)。待克隆羔羊性成熟和體成熟后對(duì)其進(jìn)行了自然交配，成年體細(xì)胞克隆羊正常順產(chǎn)2胎，均是雙胞胎。表明獲得的克隆羊具有正常的生殖和哺育后代的能力，進(jìn)一步證明，本實(shí)驗(yàn)室建立了相對(duì)穩(wěn)定的的體細(xì)胞克隆綿羊技術(shù)體系。
　　2.轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆體系的建立
　　采用組織塊種植法分離純化了約40日齡綿羊胎兒成纖維細(xì)胞；克隆了秀麗

5、隱桿線蟲fat-1基因，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行了密碼子的優(yōu)化與合成，構(gòu)建了pTFK-c和pTFK-o兩個(gè)真核表達(dá)載體。pTFK-o轉(zhuǎn)染綿羊胎兒成纖維細(xì)胞，經(jīng) G418壓力篩選后進(jìn)行轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的鑒定。結(jié)果表明獲得的7個(gè)細(xì)胞克隆中有5個(gè)細(xì)胞系的基因組中整合有目的基因，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行染色體數(shù)目分析，其核型正常率為69.77%(2n=54)，符合用于轉(zhuǎn)基因克隆的要求。
　　以篩選到的7號(hào)轉(zhuǎn)fat-1基因綿羊胎兒成纖維細(xì)胞系為核供體，綿羊去核

6、卵母細(xì)胞胞質(zhì)為核受體生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆胚。采用抽吸法共回收卵母細(xì)胞4881枚，成熟培養(yǎng)18h成熟率為72.87%。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行去核操作綿羊卵母細(xì)胞3557枚，用于融合的卵數(shù)是3305枚，共融合3040枚，融合率為91.39%。共分三組移植了處于1-細(xì)胞期的2909枚胚胎到230只羊體內(nèi)，1組移植了146只受體羊，妊娠5只，妊娠率為3.42%，產(chǎn)羔5只，產(chǎn)羔率為3.42%；2組移植了60只受體羊，妊娠18只，妊娠率為30%，產(chǎn)羔19只，產(chǎn)羔率為

7、31.67%；3組移植了24只羊，妊娠5只，妊娠率為20.83%，產(chǎn)羔6只，產(chǎn)羔率為25%。后2組實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步優(yōu)化了體細(xì)胞克隆技術(shù)體系。
　　3.轉(zhuǎn)fat-1基因克隆綿羊的出生與鑒定
　　通過實(shí)驗(yàn)共產(chǎn)羔30只，其中19只存活。對(duì)獲得的30只中的29只轉(zhuǎn)基因克隆羔羊進(jìn)行基因組水平檢測(cè)，結(jié)果顯示有27只羔羊基因組中含有目的基因?？寺⊙蚣∪饨M織中ω-6和ω-3PUFAs的相對(duì)含量檢測(cè)結(jié)果顯示，在檢測(cè)的23只羊中有18只羊都表達(dá)了