線蟲fat-1基因在家兔胎兒成纖維細(xì)胞中的表達(dá)研究.pdf

1、fat-1基因編碼ω-3多不飽和脂肪酸脫氫酶,可以將多不飽和脂肪酸從ω-6形式轉(zhuǎn)化為ω-3形式。ω-3多不飽和脂肪酸作為細(xì)胞構(gòu)成的重要成分,一直以來受到人們的廣泛關(guān)注。研究表明,哺乳動物體內(nèi)一定的ω-3多不飽和脂肪酸含量,可以起到預(yù)防心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病甚至癌癥的作用。但ω-3多不飽和脂肪酸在大多數(shù)動物體內(nèi)不能合成,只能從食物中攝取。研究人員利用轉(zhuǎn)基因的方法制備了能夠表達(dá)fat-ι基因的轉(zhuǎn)基因動物,如小鼠、豬等,為研究ω-3多不飽

2、和脂肪酸的功能提供了高效、準(zhǔn)確的醫(yī)學(xué)、營養(yǎng)學(xué)動物模型。隨著人們對ω-3多不飽和脂肪酸認(rèn)識的增加,對富含這一成分的食品需求也將大大增加,fat-1基因在生產(chǎn)特殊農(nóng)產(chǎn)品方面也具有十分大的潛力,亟待我們開發(fā)利用。本研究根據(jù)家兔基因密碼子使用偏好性,對引自GenBank的秀麗隱桿線蟲fat-1cDNA序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化,通過全基因合成的方法獲得優(yōu)化后的fat-1基因(命名為opfat-1);從秀麗隱桿線蟲中RT-PCR擴增獲得fat-1 cDN

3、A。將擴增的fat-1cDNA和合成的opfat-1基因分別構(gòu)建到綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-C1中。采用脂質(zhì)體Lipofectamine轉(zhuǎn)染法將fat-1cDNA和opfat-1基因轉(zhuǎn)入家兔胎兒成纖維細(xì)胞中。對比不同DNA和轉(zhuǎn)染試劑用量以及細(xì)胞暴露于DNA、轉(zhuǎn)染試劑中作用時間探討影響家兔胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的參數(shù),通過綠色熒光標(biāo)記、PCR和RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中融合蛋白和目的基因的表達(dá)。結(jié)果表明:經(jīng)過優(yōu)化,最優(yōu)的家兔胎兒

4、成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件為:Lipofectamine用量為2-3μl,DNA量為0.8～1.0μg, Lipofectamine與DNA、細(xì)胞共培養(yǎng)時間為8h。熒光標(biāo)記表明,密碼子優(yōu)化的opfat-1與fat-1 cDNA相比,體外瞬時表達(dá)效率有極為顯著的提高;G418抗性篩選獲得轉(zhuǎn)基因單克隆細(xì)胞,PCR、RT-PCR初步驗證fat-1 cDNA和opfat-1基因均在家兔胎兒成纖維細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄表達(dá)。作為階段性成果,本研究的結(jié)果為進(jìn)一步證